胎盤FAT/CD36表達(dá)與巨大兒發(fā)生的相關(guān)性

王晨晨，李一美，孫昊，蔡倩瑩，徐小茜，王耀成，王玉環(huán)，閆洪濤，楊新軍

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

胎盤FAT/CD36表達(dá)與巨大兒發(fā)生的相關(guān)性

王晨晨1，李一美2，孫昊1，蔡倩瑩1，徐小茜1，王耀成1，王玉環(huán)2，閆洪濤1，楊新軍1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

目的：探討胎盤組織中脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT/CD36）表達(dá)與巨大兒發(fā)生的關(guān)系。方法：選擇2014年6月至2016年6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院正常妊娠并足月分娩的89例產(chǎn)婦和新生兒為研究對(duì)象，其中44例為巨大兒，45例為正常兒。采用自制調(diào)查表收集產(chǎn)婦和新生兒的基本信息，并收集胎盤樣品。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)及Western blot法檢測(cè)巨大兒與正常兒胎盤組織中FAT/CD36基因和蛋白的表達(dá)水平，采用多因素logistic回歸進(jìn)行巨大兒發(fā)生的影響因素分析。結(jié)果：qPCR和Western blot結(jié)果顯示，巨大兒組FAT/CD36表達(dá)水平高于正常兒（P＜0.05）。多因素logistic回歸分析表明，胎盤FAT/CD36基因mRNA高表達(dá)為巨大兒發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且與孕周、孕期體質(zhì)量增加、新生兒性別共同影響巨大兒的發(fā)生。結(jié)論：FAT/CD36在胎盤組織中表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致巨大兒發(fā)生的機(jī)制之一。

FAT/CD36；巨大胎兒；胎盤

巨大兒是指出生體質(zhì)量≥4 000 g的活產(chǎn)新生兒[1]。一項(xiàng)基于14個(gè)省38家醫(yī)院的回顧性調(diào)查顯示，2011年中國(guó)巨大兒發(fā)生率為7.3%[1]，且近年來巨大兒的發(fā)生率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]。巨大兒不僅會(huì)顯著增加死胎、胎兒死亡（出生窒息導(dǎo)致）、出生損傷、胎糞吸入和剖宮產(chǎn)等產(chǎn)科問題[3]，而且會(huì)增加其成年后患糖尿病、肥胖等代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。然而，巨大兒發(fā)生的原因和機(jī)制仍不清楚。因此，開展巨大兒發(fā)生的病因?qū)W研究，進(jìn)一步揭示巨大兒的發(fā)生機(jī)制，對(duì)預(yù)防和控制巨大兒及其成年期疾病的發(fā)生具有重要的意義。脂肪酸是胎兒生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是人體細(xì)胞重要的能量來源。一項(xiàng)孕期高脂肪膳食導(dǎo)致小鼠肥胖模型的研究顯示，胎盤營(yíng)養(yǎng)素能高效地運(yùn)輸給胎兒，從而引起胎兒的過度生長(zhǎng)[6]。胎兒脂肪酸水平不僅受母體脂肪酸水平影響，還受胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)效率的影響[7]。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36）作為一種跨膜蛋白，可通過改變長(zhǎng)鏈脂肪酸（long-chain fatty acid，LCFA）的轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝過程來調(diào)節(jié)胎盤脂肪酸代謝。但是，在巨大兒發(fā)生中是否有脂肪酸代謝異常，尚不清楚。因此，本研究通過檢測(cè)胎盤FAT/CD36的表達(dá)水平，探討其對(duì)LCFA轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及與巨大兒發(fā)生的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，選擇2014年6月至2016年6月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)前檢查并在該院分娩的89例產(chǎn)婦及單胎足月新生兒。其中，巨大兒組為出生體質(zhì)量≥4 000 g的新生兒，共44例；對(duì)照組為出生體質(zhì)量在2 500～3 999 g，且與巨大兒分娩時(shí)間相差3 d以內(nèi)的新生兒，共45例。入選標(biāo)準(zhǔn)：正常妊娠、單胎、足月分娩，糖耐量試驗(yàn)正常，新生兒無先天畸形。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠合并癥者（如糖尿病、高血壓、心臟病等）、妊娠并發(fā)癥者（如胎盤異常、先兆子癇等）和新生兒先天畸形。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有產(chǎn)婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集：采用自行設(shè)計(jì)的調(diào)查表收集產(chǎn)婦和新生兒的基本信息，內(nèi)容包括產(chǎn)婦生產(chǎn)年齡、身高、孕前體質(zhì)量、孕前體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、孕期體質(zhì)量增加、分娩方式、新生兒出生體質(zhì)量及其他相關(guān)信息。

1.2.2 胎盤樣品采集與處理：胎盤娩出后，立即無菌操作取胎盤滋養(yǎng)層組織1 cm×1 cm×1 cm，放入經(jīng)DEPC處理過的凍存管中，加入RNAlater（美國(guó)Ambion公司）保存，液氮運(yùn)輸，并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 胎盤RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qPCR檢測(cè)：用Trizol法提取胎盤總RNA，取5 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采取qPCR法測(cè)定胎盤FAT/CD36表達(dá)水平，選取GAPDH作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，引物至少跨1個(gè)內(nèi)含子，以免基因組DNA污染。所用引物序列如下：FAT/CD36上游：5’-GGGTT ACATTTTCCTTGGCTAGAA-3’，下游：5’-GCAGCAACATTCAA GTTAAGCAA-3’[8]，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為76 bp；GAPDH上游：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游：5’-AGTC CTTCCACGATACCAAAG-3’[9]，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為113 bp。 qPCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex TapTM（2×）10 μL；引物（10 μmol/L）各1 μL；cDNA 1 μL；加去離子水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線與瓊脂糖凝膠電泳分析，以保證產(chǎn)物的特異性。每個(gè)樣品做3個(gè)平行管，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)胎盤組織中FAT/CD36表達(dá)水平：取胎盤組織PBS洗滌2次，棄上清，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整濃度一致，蛋白變性后-20 ℃保存。經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，兔抗人抗體一抗（美國(guó)Abcam公司）1∶2 000孵育過夜，TBST洗膜3次每次10 min，用山羊抗兔二抗（美國(guó)Abcam公司）1∶5 000常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Quantity one凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像中蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 問卷調(diào)查資料和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一錄入EpiData 3.1數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料如呈正態(tài)分布，則以±s表示，若呈非正態(tài)分布用中位數(shù)（最小值，最大值）表示。計(jì)量資料采用成組t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。采用單因素和多因素logistic回歸分析巨大兒的影響因素，以優(yōu)勢(shì)比（odd ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）來估計(jì)巨大兒發(fā)生危險(xiǎn)因素的危險(xiǎn)度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2組間產(chǎn)婦生產(chǎn)年齡、新生兒性別、分娩方式、孕期體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他因素如孕前體質(zhì)量、身高、孕前BMI、孕周、產(chǎn)次在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 胎盤FAT/CD36基因mRNA表達(dá) qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，巨大兒組FAT/CD36的mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.340，P＜0.001），見圖1。進(jìn)一步分析顯示，在男性新生兒中，巨大兒組FAT/CD36基因mRNA表達(dá)量為1.66（0.42，5.75），高于對(duì)照組的1.04（0.26，2.81），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.202，P＜0.001）。而女性新生兒中，巨大兒組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 產(chǎn)婦及新生兒臨床資料比較

圖2 2組胎盤FAT/CD36蛋白表達(dá)

2.4 巨大兒發(fā)生的影響因素分析 結(jié)合基線資料，采用多因素logistic回歸模型，對(duì)影響巨大兒發(fā)生的因素進(jìn)行篩選與分析。以是否為巨大兒為因變量，其他因素如新生兒性別、孕周、FAT/CD36基因mRNA表達(dá)量等為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果顯示，在控制了新生兒性別、孕周、孕期體質(zhì)量增加之后，胎盤FAT/CD36基因mRNA高表達(dá)為巨大兒發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且與孕周、孕期體質(zhì)量增加、男性新生兒共同影響巨大兒的發(fā)生，見表2。

3 討論

FAT/CD36又稱為FAT、GP4、GP3B、PASIV等，是一種可以轉(zhuǎn)運(yùn)LCFA的單鏈跨膜細(xì)胞表面蛋白。人的FAT/CD36含471個(gè)氨基酸殘基，由于糖基化程度不同，在不同的細(xì)胞中具有不同的分子量，為78～88 kDa[11]。FAT/CD36屬于B類清道夫受體家族蛋白成員之一，其配體包括低密度脂蛋白、天然脂蛋白、氧化的磷酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸等，F(xiàn)AT/CD36廣泛分布于脂肪、骨骼肌、胎盤等脂肪酸代謝活躍的組織中[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT/CD36敲除的小鼠骨骼肌和脂肪組織攝取和利用LCFA的速率顯著下降。當(dāng)FAT/CD36在小鼠骨骼肌細(xì)胞中過量表達(dá)時(shí)，肌細(xì)胞攝取脂肪酸的速率大幅度提高，這說明FAT/CD36在LCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用[13]。還有研究表明，F(xiàn)AT/CD36在調(diào)節(jié)心臟和骨骼肌中的LCFA利用過程中起到關(guān)鍵作用[14]。

由于胎兒自身合成LCFA功能有限，胎兒體內(nèi)LCFA主要來自胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)。胎盤LCFA的被動(dòng)擴(kuò)散需借助載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，包括胎盤脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT/ CD36、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（fatty acid transportprotein，F(xiàn)ATPs）、脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABPs）等，但只有FAT/CD36和FATP是位于絨毛膜和基底膜上，涉及到LCFA跨過整個(gè)胎盤的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織中FAT/ CD36的mRNA表達(dá)量和蛋白水平在巨大兒組中明顯上調(diào)，F(xiàn)AT/CD36可能是通過促進(jìn)LCFA在胎盤中的轉(zhuǎn)運(yùn)，加速胎兒的生長(zhǎng)和脂肪沉積，從而參與影響了巨大兒的發(fā)生。另外我們還發(fā)現(xiàn)在男性新生兒中，巨大兒比對(duì)照組FAT/CD36 mRNA表達(dá)上升，而女性新生兒中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于男性胎兒對(duì)脂肪酸需求高于女性胎兒[16]，于是FAT/CD36高表達(dá)可以轉(zhuǎn)運(yùn)更多脂肪酸來滿足男性胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，這也可以解釋目前研究發(fā)現(xiàn)巨大兒中男性新生兒多于女性新生兒的現(xiàn)象。目前關(guān)于代謝性疾病與FAT/CD36關(guān)系的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AT/CD36高表達(dá)與胰島素抵抗、脂肪分化都有密切的關(guān)系，在肥胖和2型糖尿患者群中，脂肪組織的FAT/CD36表達(dá)都高于正常人[17]。而出生為巨大兒的新生兒，其身體脂肪含量高于正常體質(zhì)量的新生兒[18]，并且巨大兒還可能增加兒童時(shí)期肥胖和成年后代謝性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)的巨大兒胎盤FAT/CD36高表達(dá)，可能是巨大兒成年后易患代謝性疾病的一個(gè)間接證據(jù)，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證明。

表2 巨大兒影響因素的logistic回歸分析

本研究還分析了影響巨大兒發(fā)生的其他因素，與以往研究[20-21]相一致，男性新生兒、孕周延長(zhǎng)、孕期體質(zhì)量增加為巨大兒發(fā)生的危險(xiǎn)因素。此外，在控制了新生兒性別、孕周、孕期體質(zhì)量增加后，胎盤FAT/CD36基因mRNA高表達(dá)顯示為巨大兒發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)參與了巨大兒的發(fā)生。

本研究也存在一些不足。由于本研究是一項(xiàng)以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照設(shè)計(jì)，可能會(huì)存在選擇偏倚，為了控制選擇偏倚，我們連續(xù)收集了本院2014 年6月至2016年6月能保證獲得全部信息的巨大兒為研究對(duì)象。另外，由于研究的樣本量有限，多因素分析模型中危險(xiǎn)度估計(jì)的可信區(qū)間較寬，可能會(huì)影響估計(jì)的精確性。

綜上所述，F(xiàn)AT/CD36基因的 mRNA和蛋白表達(dá)水平在巨大兒胎盤組織中呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，提示FAT/CD36基因可能參與了胎盤LCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)從而調(diào)節(jié)新生兒出生體質(zhì)量，影響巨大兒發(fā)生。這為尋找巨大兒發(fā)生原因及其成年后代謝相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制，提供了新的理論依據(jù)。

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（本文編輯：賈建敏）

Correlation between FAT/CD36 expression in placenta and macrosomia

WANG Chenchen1, LI Yimei2, SUN Hao1, CAI Qianying1, XU Xiaoxi1, WANG Yaocheng1, WANG Yuhuan2, YAN Hongtao1, YANG Xinjun1.
1.Department of Preventive Medicine, School of Public Health and Management, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Obstetrics, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To explore the correlation between expression of FAT/CD36 in placenta and macrosomia.Methods:The cases were collected from June 2014 to June 2016 in the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, including 44 macrosomia newborns and 45 normal birth weight newborns. A self-designed questionnaire was used to collect related information of pregnant women and their neonates, real-time fl uorescent quantitative PCR (qPCR) was used to detect FAT/CD36 mRNA expression in placenta. Western blot was used to detect FAT/CD36 protein expression. The infl uencing factors of macrosomia were analyzed by multivariate logistic regression model.Results:qPCR and Western blot showed FAT/CD36 expression of macrosomia was signifi cantly higher than that of healthy controls (P＜0.05). The result of multivariate logistic regression analysis showed that high expression of FAT/CD36 mRNA expression was a risk factor, and the occurrence of macrosomia was infl uenced by gestational age, gestational weight gain and newborns sex.Conclusion:The up-regulation of FAT/CD36 in placenta may be correlated with macrosomia.

FAT/CD36; fetal macrosomia; placenta

R114

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.006

2016-10-31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072378）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2101185）。

王晨晨（1991-），女，河南洛陽人，碩士生。

楊新軍，教授，Email：xjyang@wmu.edu.cn。