齊墩果酸-阿司匹林綴合物促骨形成效果研究

吉璐宏 趙庭波

齊墩果酸-阿司匹林綴合物促骨形成效果研究

吉璐宏 趙庭波

目的 探討齊墩果酸-阿司匹林綴合物對(duì)血清素合成的抑制活性以及促骨形成活性。方法 采用高效液相色譜和ELISA試劑盒測(cè)試齊墩果酸-阿司匹林綴合物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞中血清素合成的關(guān)鍵酶色氨酸羥化酶-1(TPH-1)的抑制率及含量。構(gòu)建去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型 (osteoporosis in ovariectomized rats,OVX)，并將骨質(zhì)疏松大鼠隨機(jī)分為齊墩果酸齊墩果酸-阿司匹林綴合物組、齊墩果酸和阿司匹林物理混合組、齊墩果酸組、阿司匹林物組、空白對(duì)照組 (OVX組)組、假手術(shù)組 (sham組)和陽(yáng)性藥物對(duì)照組，每組5只，給藥35 d后采用高效液相色譜測(cè)試血清和小腸中血清素水平。采用MTT法測(cè)試綴合物對(duì)成骨細(xì)胞促進(jìn)活性。結(jié)果 在RBL-2H3細(xì)胞中，齊墩果酸-阿司匹林綴合物對(duì)于TPH-1的抑制呈劑量依賴性，抑制率為11.9%～87.2%，其中綴合物3在10 μmol/L濃度下展現(xiàn)出了最高抑制率 (87.2%)，并能較空白組 (216 ng/ml)顯著地降低TPH-1含量(65 ng/ml)，甚至略強(qiáng)于陽(yáng)性藥物組(69 ng/ml)。與假手術(shù)組 (sham組)相比，大鼠摘除卵巢 (OVX組)后血清和小腸中血清素的水平明顯增高，而經(jīng)過(guò)給綴合物后的大鼠血清和小腸中血清素的水平卻明顯降低，其中綴合物3降低血清素的活性或較齊墩果酸組和阿司匹林物組的2.3倍以上；此外，齊墩果酸-阿司匹林綴合物能夠促進(jìn)乳小鼠成骨細(xì)胞增殖。結(jié)論 本研究為開(kāi)發(fā)齊墩果酸類抗骨質(zhì)疏松類藥物提供了新的思路。

齊墩果酸-阿司匹林綴合物；血清素；骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種在老年人和絕經(jīng)后女性中最常見(jiàn)的骨科疾病，主要特征是骨量減少、骨密度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)退化，從而導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加和易骨折[1]。與正常的組織一樣，骨組織也存在著穩(wěn)定的新陳代謝，即由成骨細(xì)胞行使骨形成和破骨細(xì)胞 (osteoclast,OC)行使骨吸收來(lái)維持骨的生理結(jié)構(gòu)。正常情況下，骨形成的速度和骨吸收的速度大致相等，處于動(dòng)態(tài)平衡。一旦這種平衡被打破，使得骨形成的速度低于骨吸收的速度就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[2]。因此，目前治療骨質(zhì)疏松的藥物可以分為促骨形成和抑制骨吸收兩類[3]。但當(dāng)前治療骨質(zhì)疏松的藥物以骨吸收抑制 (如雙膦酸鹽、雌激素等)為主[3,4]，雖然這些藥物能夠有效的防止骨骼進(jìn)一步流失，但只停留在改善癥狀，卻沒(méi)有達(dá)到逆轉(zhuǎn)病情或治愈的效果。因此，開(kāi)發(fā)出促進(jìn)骨形成的藥物已經(jīng)成為抗骨質(zhì)疏松藥物研究的熱點(diǎn)。然而令人遺憾的是，目前促進(jìn)骨細(xì)胞形成類藥物卻只有甲狀旁腺 (PTH-1)，而該藥物能夠增加患者骨肉瘤發(fā)病率的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，開(kāi)發(fā)出新型、高效、低毒副作用的促成骨細(xì)胞形成類藥物具有重要的意義。

從天然產(chǎn)物中尋找和發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物已成為開(kāi)發(fā)新藥的重要途徑。齊墩果酸 (Oleanolic acid)是一種五環(huán)三萜類化合物，以游離或糖苷的形式廣泛的分布在多種植物中，并具有抗腫瘤、抗炎、降血糖等多種藥理活性[6-8]，而且副作用小、毒性低，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)初步的研究我們發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能夠抑制腸源血清素(5-羥色胺,5-HT)，而血清素進(jìn)入血液循環(huán)后通過(guò)抑制骨細(xì)胞分化和增殖進(jìn)而減少骨形成[9-11]，因此，齊墩果酸是一類促有進(jìn)成骨細(xì)胞形成的新型抗骨質(zhì)疏松藥物。近年來(lái)，老藥新用也是新藥開(kāi)發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)，例如阿司匹林 (Aspirin)是一個(gè)具有100多年歷史的非甾體抗炎藥，并具有較低的副作用，在這100多年里人們發(fā)現(xiàn)阿司匹林還能治療偏頭痛、老年癡呆癥、結(jié)腸癌等多種新用途。最近研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林還能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，提高骨密度的作用，具有抗骨質(zhì)疏松的活性[12,13]。

基于齊墩果酸和阿司匹林展現(xiàn)出的促骨形成的藥理活性，根據(jù)亞結(jié)構(gòu)拼接和活性疊加的原理，我們將齊墩果酸和阿司匹林進(jìn)行拼接以期得到活性更強(qiáng)、毒性更低的新型具有促骨形成作用的齊墩果酸衍生物。本研究探討了齊墩果酸-阿司匹林綴合物 (圖 1)對(duì)血清素合成的影響以及對(duì)骨細(xì)胞形成的作用。結(jié)果表明，測(cè)試的齊墩果酸-阿司匹林綴合物對(duì)腸源血清素均有抑制作用，其中綴合物3展現(xiàn)出了最強(qiáng)的活性，并能顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞增值。

圖1 齊墩果酸、阿司匹林以及齊墩果酸-阿司匹林綴合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 齊墩果酸、阿司匹林均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；齊墩果酸-阿司匹林綴合物由武漢大學(xué)劉遠(yuǎn)教授合成和結(jié)構(gòu)確證；色氨酸羥化酶-1 (TPH-1) ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢Cusabio公司；5-羥色胺 (5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海生物科技有限公司；甲狀旁腺激素 (PTH) 購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；二甲基亞砜等其他試劑均為分析純；RBL-2H3細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞典藏中心。動(dòng)物：SD大鼠，體重200～250 g，雌性，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK (鄂) 2008-0004；動(dòng)物級(jí)別：SPF級(jí)。

1.2 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；BP211D型電子天平(北京和悅達(dá)科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；BB16/BB5060儀器CO2培養(yǎng)箱(上海力創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司)；CKX31型倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；ELx800通用酶標(biāo)儀 (美國(guó)BioTek公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腸源性血清素合成抑制測(cè)試：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBL-2H3細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，鋪至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后加入不同濃度的測(cè)試藥物，終濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，對(duì)照組僅加入溶劑DMSO (1 μl/ml培養(yǎng)液)，培養(yǎng)2 d后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌，然后每孔加入100 μl RIPA強(qiáng)裂解液裂解細(xì)胞，再加入200 μl PBS稀釋，離心后直接用HPLC測(cè)定血清素(5-羥色胺，5-HT)的峰面積，并計(jì)算出藥物的對(duì)5-HT生物合成的抑制率。抑制率通過(guò)積分面積比可得，其計(jì)算公式為：抑制率(%)=100%-測(cè)試化合物峰面積/對(duì)照組峰面積。抑制率數(shù)值越大，表明綴合物對(duì)血清素的生物合成抑制作用就越強(qiáng)。

1.3.2 綴合物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞毒性的MTT檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBL-2H3細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入100 μl的含有測(cè)試藥物的培養(yǎng)液，終濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 d后，每孔加入30 μl 5 mg/ml MTT，繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入100 μl二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(OD)值。

1.3.3 綴合物對(duì)TPH-1蛋白量的影響：首先用ELISA試劑盒，繪制TPH-1蛋白量-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過(guò)測(cè)試三萜類化合物與RBL-2H3細(xì)胞相互作用后的吸光度值計(jì)算出不同濃度綴合物對(duì)應(yīng)的TPH-1蛋白量，從而確定化合物對(duì)TPH-1蛋白量的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBL-2H3細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入500 μl的含有測(cè)試藥物 (對(duì)照組不加藥物)的培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d后，棄去培養(yǎng)液，并用PBS洗滌，然后將細(xì)胞反復(fù)的凍融，收集裂解液用ELISA試劑盒測(cè)試，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值。見(jiàn)圖2。

圖2 TPH-1含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 體內(nèi)抑制血清素合成測(cè)試：將11周大的雌鼠分為給藥組(30 mg·kg-1·d-1組)、空白組、陽(yáng)性藥對(duì)照組和假手術(shù)組，每組5只。在摘除卵巢造模術(shù)后第4天開(kāi)始灌胃給藥，其中陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射20 g·kg-1·d-1的PTH，連續(xù)給藥35 d后頸動(dòng)脈取血。將血液在37℃下靜置45 min后得到的血清用HPLC測(cè)試其血清素的含量；小腸則在酸化后測(cè)試其血清素，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。見(jiàn)圖3。

圖3 5-HT含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.5 促進(jìn)骨細(xì)胞增值：無(wú)菌條件下將20只出生 2～3 d的乳小鼠處死，取出其頭蓋并刮去軟組織，PBS清洗，剪碎后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用混合酶 (0.25%胰酶+0.1%的Ⅱ型膠原酶=1∶1)，37℃消化15 min棄去上清液；再用0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化5次，合并上清液并用培養(yǎng)基終止消化，將上清液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)4 d，洗去未貼壁的細(xì)胞，剩下的細(xì)胞即為成骨細(xì)胞；接著，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入不同濃度的測(cè)試藥物，終濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，對(duì)照組僅加入溶劑DMSO (1 μl/ml培養(yǎng)液)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 d后棄去培養(yǎng)液，每孔加入30 μl 5 mg/ml MTT，繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入100 μl二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的吸光度(OD)值。

2 結(jié)果

2.1 體外抑制血清素合成的性 與齊墩果酸、阿司匹林和齊墩果酸+阿司匹林混合組相比，綴合物抑制血清素的能力明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性；與陽(yáng)性藥物L(fēng)P533401相比，綴合物在5 μmol/L和10 μmol/L的濃度下抑制血清素的能力明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 體外抑制血清素合成的抑制活性 與齊墩果酸、阿司匹林和齊墩果酸+阿司匹林混合組相比，目標(biāo)綴合物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞均沒(méi)有明顯的毒性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制腸源性血清素的合成作用 ±s

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與OA組比較，*P<0.05；與阿司匹林組比較，#P<0.05；與OA+阿司匹林混合組比較，△P<0.05

組別Inhibition(%)2．5μmol/L5μmol/L10μmol/L空白組0．0±0．030．0±0．040．0±0．02齊墩果酸1．4±0．17?3．2±0．61?5．2±0．78?阿司匹林1．1±0．09?2．4±0．27?4．2±0．45?齊墩果酸+阿司匹林a1．3±0．15?2．8±0．22?4．6±0．69?12．5±0．41?3．1±0．84?3．9±0．82?23．0±0．62?4．2±1．25?5．4±0．93?32．8±1．07?3．5±0．44?4．2±0．51?42．1±0．72?3．9±0．99?4．9±1．36?51．7±0．34?2．9±1．73?5．1±1．65?LP5334014．8±1．81?5．5±1．57?6．2±1．28?

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與空白組比較，*P<0.05

2.3 齊墩果酸-阿司匹林綴合物對(duì)TPH-1蛋白量的影響 與空白對(duì)照組相比，綴合物在10 μmol/L的濃度下能明顯地抑制TPH-1蛋白生成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3,圖4。

組別覽TPH?1含量空白組216±12齊墩果酸177±10?阿司匹林192±15?齊墩果酸+阿司匹林a146±10?1104±9? 2127±6? 365±5# 4112±6? 573±4# LP53340169±3#

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與空白組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.4 綴合物對(duì)OVX大鼠血清和腸中血清素的影響 與假手術(shù)組(Sham)相比，OVX組血清和小腸中血清素水平均顯著地升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與卵巢切除組相比，綴合物在10 μmol/L的濃度下能明顯地降低血清和小腸中血清素水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。見(jiàn)表4,圖5。

2.5 綴合物促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖 與空白對(duì)照組比較，綴合物顯著地抑促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。見(jiàn)表5,圖6。

圖4 齊墩果酸-阿司匹林綴合物對(duì)TPH-1蛋白量的影響。每組數(shù)據(jù)都是平均值±SD,n=3.*P<0.05,#P<0.01 vs 空白對(duì)照組

表4 齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制體內(nèi)血清素的合成 ±s

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與卵巢切除組比較，#P<0.05，△P<0.01

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是由于骨吸收超過(guò)骨形成所致，因此促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性是治療骨質(zhì)疏松癥的重要方法。本研究以色氨酸羥化酶-1(TPH-1)為靶點(diǎn)，探討了齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制腸源性血清素合成的活性以及成骨細(xì)胞的活性。從表1中可以看出這些齊墩果酸-阿司匹林綴合物對(duì)血清素均有抑制作用，其抑制率為11.9%～87.2%，強(qiáng)于先導(dǎo)化合物齊墩果酸和阿司匹林，并呈劑量依賴關(guān)系；與齊墩果酸和阿司匹林的物理混合組相比，這些通過(guò)化學(xué)合成的綴合物對(duì)血清素的抑制作用明顯地高于物理混合組 (抑制率< 9%)，尤其是綴合物3在10 μmol/L的濃度下對(duì)血清素的抑制作用最強(qiáng)，抑制率高達(dá)87.2%，分別是齊墩果酸 (抑制率7.1%)和阿司匹林 (抑制率4.5%)的12和14倍，甚至高于陽(yáng)性藥物L(fēng)P533401(抑制率84.6%)。但是，綴合物之間卻有較大的差異。從結(jié)構(gòu)上看，綴合物1是將阿司匹林的羧基拼接在齊墩果酸的C3位羥基上，其在10 μmol/L的濃度下對(duì)血清素展現(xiàn)出了中等的抑制作用，而將阿司匹林的羧基拼接到齊墩果醇C17羥基 (綴合物2)后卻顯著地降低了活性 (綴合物1 vs 2)，然而將阿司匹林的羥基拼接到齊墩果酸C17位羧基 (綴合物3)上卻明顯地增加了活性 (綴合物2 vs 3)，這些說(shuō)明結(jié)果齊墩果酸C17的羰基是一個(gè)藥效團(tuán)，能夠增加對(duì)血清素抑制活性；同時(shí)，比較綴合物1 和3可以發(fā)現(xiàn)，將阿司匹林拼接在齊墩果酸C17位的活性要高于在C3位。繼續(xù)將在綴合物2的C3位羥基引入另一分子阿司匹林 (綴合物4)能夠提高活性，但仍然低于綴合物3，同樣地在綴合物3的C3位羥基繼續(xù)引入另一分子阿司匹林 (綴合物5)也沒(méi)有顯著地提高活性，這些結(jié)果說(shuō)明齊墩果酸C3位羥基不是藥效團(tuán)，對(duì)其修飾并不能顯著地提高活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)五環(huán)三萜類化合物對(duì)血清素的抑制活性不是來(lái)源于其對(duì)RBL-2H3細(xì)胞的毒性，而是來(lái)源于其對(duì)TPH-1的抑制活性，并能夠明顯地抑制TPH-1蛋白含量，并呈劑量依賴性。在動(dòng)物水平上，大鼠摘除卵巢后血清和小腸中的血清素的水平均顯著地增高(卵巢切除組vs 假手術(shù)組)，而經(jīng)過(guò)綴合物給藥后的大鼠血清和小腸中的血清素水平卻明顯地降低，其抑制血清素的作用也強(qiáng)于齊墩果酸、阿司匹林和齊墩果酸與阿司匹林混合物，其中綴合物3抑制血清素作用甚至強(qiáng)于陽(yáng)性藥物L(fēng)P533401。這些結(jié)果說(shuō)明綴合物在動(dòng)物體內(nèi)也能夠抑制血清素的合成。在促進(jìn)成骨細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)綴合物也能夠顯著地促進(jìn)乳小鼠成骨細(xì)胞增殖，其中綴合物3展現(xiàn)出了最強(qiáng)的活性。

假手術(shù)組(sham)摘除卵巢大鼠

圖5 齊墩果酸-阿司匹林綴合物抑制體內(nèi)血清素的合成；(A)和(B)分別為假手術(shù)組 (Sham)與摘除卵巢大鼠血清和小腸的血清素水平；每組數(shù)據(jù)都是平均值±SD,n=5；與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.01;△P<0.01

表5 齊墩果酸-阿司匹林綴合物促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖效果 ±s

注：齊墩果酸+阿司匹林為摩爾比1∶1混合給藥；與空白組比較，*P<0.05

圖6 齊墩果酸-阿司匹林綴合物促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖效果；每組數(shù)據(jù)都是平均值±SD,n=3；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

綜上所述，齊墩果酸-阿司匹林綴合物能夠有效地抑制腸源性的血清素的合成并促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，尤其是綴合物3在體外和動(dòng)物體內(nèi)均展現(xiàn)出了對(duì)血清素合成最強(qiáng)的抑制活性以及促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活性。對(duì)于齊墩果酸-阿司匹林綴合物促進(jìn)成骨的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

1 吳青,陳麗花.治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床分析.中國(guó)婦幼保健研究,2013,24:584-585.

2 王欣榮,應(yīng)漢杰,歐陽(yáng)平凱.骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理及其治療.生物工程進(jìn)展,2001,21:54-56.

3 張燕燕,盧春燕,劉斌.骨質(zhì)疏松癥的藥物治療.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2007,13:809-812.

4 汪呈,曹宇,顧永清,等.骨質(zhì)疏松癥的藥物治療.科學(xué)通報(bào),2014,59:1209-1214.

5 Pleiner-Duxneuner J,Zwettler E,Paschalis E,et al.Treatment of osteoporosis with parathyroid hormone and teriparatide.Calcif Tissue Int,2009,84:159-170.

6 Sommerwerk S,Heller L,Kuhfs J,et al. Urea derivates of ursolic,oleanolic and maslinic acid induce apoptosis and are selective cytotoxic for several human tumor cell lines. Eur J Med Chem,2016,119:1-16.

7 Nelson,AT,Camelio AM,Claussen KR,et al. Synthesis of oxygenated oleanolic and ursolic acid derivatives with anti-inflammatory prope-rtyes.Bioorg Med Chem Lett,2015,25: 4342-4346.

8 Nie W,Luo JG,Wang XB,et al.Synthesis of new α-glucosidase inhibitors based on oleanolic acid incorporating cinnamic amides.Chem Pham Bull,2011,59:1051-1056.

9 Saarinen A,Saukkonen T,Kivel T,et al. Low density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) mutations and osteoporosis,impaired glucose metabolism and hypercholesterolaemia.Clin Endocrinol(Oxf),2010,72:481-488.

10 Rosen CJ. Serotonin rising--the bone,brain,bowel connection.N Eng J Med,2009,360:957-959.

11 Yadav VK,Oury F,Suda N,et al. A serotonin-dependent mechanism explains the leptin regulation of bone mass,appetite,and energy expenditure. Cell,2009,138:976-989.

12 陳志文,吳子祥,桑宏勛,等.阿司匹林治療大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究.中華醫(yī)學(xué)雜志,2011,91:925-929.

13 王建超,頡強(qiáng),桑宏勛,等.阿司匹林預(yù)防去卵巢大鼠骨量丟失.中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志,2012,5:111-118.

Experimental study of the effects of oleanolic acid-aspirin conjugates on bone formation

JILuhong,ZHAOTingbo.

DepartmentofOrthopaedics,TheFirstHospitalofXiantaoCity,Hubei,Xiantao433000,China

Objective To investigate the effects of oleanolic acid-aspirin conjugateson in inhibiting serotonin biosynthesis and promoting bone formation. Methods The inhibitor rate and contents of oleanolic acid-aspirin conjugates on tryptophan hydroxylase 1 (TPH-1) in RBL-2H3 cells,which was the principal enzyme in biosynthesis of serotonin,were detected by HPLC and ELISA kit. The rat models with osteoporosis were established by ovariectomy (OVX). Then the rats were randomly divided into oleanolic acid-aspirin conjugates group, oleanolic acid+aspirin group, oleanolic acid group (OA group),aspirin group,blank control group (OVX group),sham operation group (sham group) and positive drug control group,with 5 rats in each group. After 35-day medication,the levels of serotonin in serum and small intestine were detected by HPLC method,and the osteoblasts activities of promoting osteoblasts proliferation of oleanolic acid-aspirin conjugates were evaluated by using MTT assay.Results As compared with that in OA group, aspirin group and OA+aspirin group, the inhibitory ability on serotonin in oleanolic acid-aspirin conjugates group was significantly increased (P<0.05),with a dose-dependent manner. As compared with that in positive drug control group (LP533401), the inhibitory ability on serotonin in oleanolic acid-aspirin conjugates group at the concentration of 5μmol/L and 10μmol/L was significantly increased (P<0.05). As compared with OA group, aspirin group,OA+aspirin group, and oleanolic acid-aspirin conjugates group had no obvious toxicity on RBL-2H3 cells (P>0.05). As compared with OVX group,the oleanolic acid-aspirin conjugates group at the concentration of 10μmol/L could obviously inhibit the TPH-1 protein production (P<0.05). As compared with those in sham operation group, the levels of serotonin in serum and small intestine in OVX group were significantly increased (P<0.05). As compared with OVX group, the oleanolic acid-aspirin conjugates group at concentration of 10μmol/L could obviously decrease the levels of serotonin in serum and small intestine of rats (P<0.05).Moreover,as compared with OVX group, the oleanolic acid-aspirin conjugates could significantly inhibit osteoblasts formation (P<0.05). Conclusion The research results provide an new idea for development of anti-osteoporosis drugs like OA.

oleanolic acid;aspirin conjugate; serotonin; osteoporosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.004

433000 湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院骨外二科

R 336

A

1002-7386(2017)15-2258-06

2016-11-11)