巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)法制備還原響應(yīng)兩親性聚合物*

盧彥兵,謝元彬,夏迎春

(湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410082)

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巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)法制備還原響應(yīng)兩親性聚合物*

盧彥兵?,謝元彬,夏迎春

(湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410082)

以胱胺二鹽酸鹽、氯甲酸烯丙酯、1,6-己二硫醇及端巰基聚乙二醇單甲醚等為原料，通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，合成了疏水段含二硫鍵的兩親性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG.對(duì)mPEG-b-P1-b-mPEG在水溶液中的自組裝行為進(jìn)行了深入的研究.結(jié)果表明，mPEG-b-P1-b-mPEG的臨界膠束濃度為0.032 mg/mL，形成膠束的平均粒徑為61.3 nm.包載模擬藥物尼羅紅的釋放行為研究表明，在D,L-二硫蘇糖醇(DTT)存在的條件下，包裹在膠束中的尼羅紅可以被釋放出來(lái)，顯示出快速的還原響應(yīng)性能，表明合成的兩親性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG有望作為疏水性藥物載體，應(yīng)用于藥物控釋領(lǐng)域.

兩親性聚合物；巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)；還原響應(yīng)性；膠束；藥物控釋

作為環(huán)境響應(yīng)聚合物的一種，分子結(jié)構(gòu)內(nèi)含二硫鍵的還原響應(yīng)聚合物引起了人們的關(guān)注.二硫鍵具有在體內(nèi)血液循環(huán)過(guò)程中可以長(zhǎng)期穩(wěn)定存在,但是在存在還原劑的條件下會(huì)發(fā)生斷裂.癌細(xì)胞與正常細(xì)胞相比含有大量的谷胱甘肽(GSH)，作為一種還原劑，它在癌細(xì)胞中的量足可以將二硫鍵還原.根據(jù)這一特性，設(shè)計(jì)研發(fā)了大量具有二硫鍵的還原響應(yīng)性聚合物膠束[1-3].Tang等[4]合成了一種以聚磷酸酯作為親水鏈段、聚己內(nèi)酯作為疏水鏈段，中間用二硫鍵連接的兩親性聚合物聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯(PCL-SS-PEEP).在體外藥物釋放的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)包載有阿霉素(DOX)的這種膠束，在10 mM GSH存在下，100 h內(nèi)DOX基本全部釋放完畢，而在沒(méi)有GSH存在條件下，載藥膠束在100 h內(nèi)只釋放出約40%的DOX藥物.Wei等[5]通過(guò)可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)合成了聚乙二醇-b-聚(N-羥丙基甲基丙烯酰胺)-硫辛酸(PEG-b-PHPMA-LA).兩親性聚合物PEG-b-PHPMA-LA可以在催化劑DTT(D,L-二硫蘇糖醇)的作用下,發(fā)生核交聯(lián),使得形成的膠束變得更加穩(wěn)定.在沒(méi)有DTT的作用下,經(jīng)過(guò)24 h后，沒(méi)有交聯(lián)的膠束的DOX釋放量達(dá)到85%,而交聯(lián)后的膠束的DOX釋放量只有20%左右.當(dāng)DTT的濃度為10 mM時(shí),經(jīng)過(guò)24 h后,交聯(lián)后的膠束的DOX釋放量達(dá)到90%.Liu等[6]以二硫二吡啶和1,6-己二硫醇為原料，通過(guò)縮聚反應(yīng)，制備了端基為二硫吡啶、主鏈中含二硫鍵的聚合物，進(jìn)而通過(guò)選擇性巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，合成了ABA型兩親型三嵌段聚合物,對(duì)其還原響應(yīng)性能進(jìn)行了深入的研究，合成路線見(jiàn)圖1.

圖1 疏水聚合物P1及兩親性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的合成路線圖Fig.1 Synthesis of hydrophobic polymer P1 and amphiphilic triblock polymer mPEG-b-P1-b-mPEG

本文以胱胺二鹽酸鹽、氯甲酸烯丙酯、1,6-己二硫醇及端巰基聚乙二醇單甲醚等為原料，通過(guò)連續(xù)的巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)，將二硫鍵引入聚合物疏水鏈段，制備具有還原響應(yīng)性的兩親性聚合物，對(duì)其自組裝行為及聚合物膠束的還原響應(yīng)性能進(jìn)行深入的探索.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

胱胺二鹽酸鹽(97%)、氯甲酸烯丙酯(分析純)、安息香二甲醚(分析純)、D,L-二硫蘇糖醇(分析純)及1,6-己二硫醇(98%)購(gòu)自上海安耐吉試劑有限公司；端巰基聚乙二醇單甲醚(自制[7]，聚乙二醇單甲醚數(shù)均分子量2000)；其它溶劑均為化學(xué)純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含二硫鍵的二烯丙基單體M1的制備

稱取4.50 g(0.02 mol)胱胺二鹽酸鹽溶解于80 mL H2O/1,4-二氧六環(huán)混合溶劑(體積比為1∶1)中;加入13.44 g(0.16 mol)碳酸氫鈉，0 ℃條件下攪拌至不再有氣泡生成.用恒壓滴液漏斗逐滴滴加6.03 g(0.05 mol)氯甲酸烯丙酯，室溫下反應(yīng)24 h之后停止反應(yīng).向溶液中加入100 mL飽和食鹽水，用100 mL二氯甲烷萃取四次；萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后旋蒸得到無(wú)色油狀物質(zhì)，柱分離(二氯甲烷為洗脫劑)后得白色晶體含二硫鍵的二烯丙基單體M1，產(chǎn)率為54%.1H NMR (400 MHz，CDCl3，TMS)：δ(ppm)：2.75 (t，4H)，3.45 (m，4H)，4.5 (d,4H)，5.15 (d，2H)，5.25 (d,4H)，5.86 (m，2H).

1.2.2 端基為烯丙基的疏水聚合物P1的制備

稱取合成的含二硫鍵的二烯丙基單體M1 0.40 g(1.25 mM)溶解于1 mL N,N-二甲基酰胺(DMF)中，加入15 mg(0.058 mM) 安息香二甲醚(DMPA)及0.156 g(1.04 mM)1,6-己二硫醇后，室溫下365 nm紫外光照2 h，生成白色沉淀，停止反應(yīng).白色沉淀離心后，加入2 mL三氯甲烷將其完全溶解，再加入冰乙醚，析出白色絮狀物，離心后得到棕黃色油狀物質(zhì)，甲醇洗滌三次后真空干燥得棕黃色的端基為烯丙基的疏水聚合物P1，產(chǎn)率為78%.

1.2.3 兩親性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的制備

稱取合成的疏水段聚合物P1 0.1 g(0.018 mM)溶解于1 mL三氯甲烷溶中，加入0.12 g(0.056 mM)端巰基聚乙二醇單甲醚 (mPEG-SH)和15 mg(0.058 mM)DMPA，室溫下365 nm紫外光照0.5 h.將溶液用去離子水透析24 h(選擇截止分子量為3500 Da的透析袋，隔12 h換一次去離子水)除去三氯甲烷.得到的白色固體真空干燥后得到兩親性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG 148 mg，收率為83%.

表1 疏水性聚合物P1和兩親性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的合成Tab.1 Synthesis of hydrophobic polymer P1 and amphiphilic triblock copolymer mPEG-b-P1-b-mPEG

a聚合物的數(shù)均分子量(Mn，GPC)和分散性系數(shù)(Mw/Mn)由GPC測(cè)定.b數(shù)均分量(Mn，NMR)由1H NMR測(cè)定.

1.2.4 聚合物膠束的制備

稱取5 mg mPEG-b-P1-b-mPEG溶解于1 mL DMF中，快速攪拌下緩慢滴加10 mL去離子水，繼續(xù)攪拌2 h.將溶液用去離子水透析24 h(選擇截止分子量為3500 Da的透析袋，隔12 h換一次去離子水)除去DMF溶劑.用去離子水將聚合物溶液定容至25 mL，得到濃度為0.2 mg/mL的聚合物膠束.

1.2.5 聚合物臨界膠束濃度的測(cè)定

以疏水性尼羅紅為探針，采用熒光光譜法測(cè)定聚合物臨界膠束濃度.取30 μL濃度為0.1 mg/mL的尼羅紅四氫呋喃溶液，用微量注射器注入小玻璃瓶.在蒸干四氫呋喃后，加入4 mL的膠束溶液，膠束溶液的濃度從0.2到2×10-4mg/mL不等.然后繼續(xù)攪拌溶液12 h進(jìn)行熒光測(cè)試.測(cè)試激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為560 nm到750 nm.

1.2.6 聚合物膠束還原響應(yīng)性能測(cè)試

在尼羅紅濃度為1.5×10-3mg/mL的條件下，分別測(cè)試在含和不含10 mM DTT時(shí)mPEG-b-P1-b-mPEG膠束(0.2 mg/mL)的熒光發(fā)射光譜的變化

1.3 表征與測(cè)試

單體及聚合物的1H NMR核磁共振譜由INOVA-400核磁共振儀測(cè)得，以TMS為內(nèi)標(biāo).嵌段共聚物的凝膠滲透色譜由Waters 1515凝膠滲透色譜儀在THF溶液中測(cè)得，使用標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯為參照.熒光光譜由HITACHI F-4600熒光分光光度計(jì)在激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm的條件下測(cè)得.透視電鏡圖由Tecnai G2 F20 S-twin透射電子顯微鏡在80 kV的條件下測(cè)得.動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試使用了Nano-ZS9電動(dòng)電位和粒子分析儀.

2 結(jié)果與討論

2.1 兩親性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的合成與表征

以胱胺二鹽酸鹽、氯甲酸烯丙酯為原料，合成了分子結(jié)構(gòu)中含二硫鍵的二烯丙基單體M1，進(jìn)而與1,6-己二硫醇在365 nm紫外光照下，利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，制備端基為烯丙基結(jié)構(gòu)的疏水性聚合物，結(jié)果見(jiàn)表1.當(dāng)兩種單體物質(zhì)的量比為1.2∶1時(shí)，通過(guò)核磁共振譜圖積分面積計(jì)算得到的聚合物分子量為4.1 kDa，GPC測(cè)試結(jié)果表明聚合物的分子量呈單峰狀.同樣，利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，合成的端基為烯丙基的疏水聚合物P1與端巰基聚乙二醇單甲醚進(jìn)行反應(yīng)，制備疏水段含二硫鍵的兩親性三嵌段聚合物，其核磁共振譜圖見(jiàn)圖2.由mPEG-b-P1a-b-mPEG的1H NMR可以看出，單體M1及疏水聚合物P1在5～6 ppm之間的對(duì)應(yīng)于雙鍵的質(zhì)子峰消失，且在3～3.5 ppm附近出現(xiàn)mPEG的吸收峰，表明嵌段聚合物已經(jīng)成功制備.

2.2 兩親性聚合物的自組裝

兩親性聚合物可以在選擇性溶劑中自組裝形成聚合物膠束或者囊泡等組裝體.通過(guò)溶劑交換法制備了mPEG-b-P1-b-mPEG聚合物膠束，并對(duì)其自組裝進(jìn)行了深入的研究.

圖2 單體及聚合物的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectra of the monomer and polymers

從圖3中可以看出，當(dāng)聚合物濃度低于一定值時(shí)，尼羅紅的熒光強(qiáng)度基本保持不變，這說(shuō)明此時(shí)的聚合物濃度低于聚合物的臨界膠束濃度，沒(méi)有形成聚合物膠束，但是當(dāng)膠束濃度超過(guò)時(shí)，熒光強(qiáng)度則快速增加，這表明聚合物溶液濃度達(dá)到了聚合物的臨界膠束濃度，尼羅紅被包裹在了膠束的疏水區(qū)域內(nèi).圖3(b)中，交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的膠束濃度就是兩親性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG的臨界膠束濃度，為0.032 mg/mL.

采用TEM和DLS對(duì)兩親性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG膠束的形貌以及平均粒徑進(jìn)行了測(cè)試.TEM測(cè)試結(jié)果顯示，聚合物膠束為球型，平均粒徑為50 nm左右.而DLS測(cè)試聚合物膠束的平均粒徑是在61.3 nm，膠束粒徑分布較窄，PDI為0.216.兩種測(cè)試中膠束平均粒徑的差異主要是由于TEM測(cè)試制樣過(guò)程中，膠束外殼PEG在干燥時(shí)失水收縮，導(dǎo)致膠束的平均粒徑小于在其水溶液中的平均粒徑[8～10].

2.3 聚合物膠束的還原響應(yīng)性研究

由于疏水鏈段主鏈結(jié)構(gòu)中含可被還原而斷裂的二硫鍵，利用DLS對(duì)兩親性mPEG-b-P1a-b-mPEG膠束在加入還原劑DTT后的粒徑變化進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖3(d).由圖3(d)可以看出，在加入DTT后，聚合物膠束的粒徑迅速變小，2 h和5 h時(shí)聚合物膠束的平均粒徑分別減小為31.1 nm和21.5 nm.這主要是由于DTT存在時(shí)，聚合物主鏈的二硫鍵被還原而發(fā)生斷裂，使得聚合物膠束結(jié)構(gòu)被破壞.

圖3 兩親性三嵌段聚合物mPEG-b-P1a-b-mPEG聚合物膠束的表征Fig.3 Characterization of the amphiphilic triblock polymer mPEG-b-P1a-b-mPEG micelles

為進(jìn)一步考察mPEG-b-P1a-b-mPEG聚合物膠束的還原響應(yīng)性能及其在藥物控釋領(lǐng)域的應(yīng)用可能性，對(duì)包載模擬藥物尼羅紅分子的聚合物膠束在DTT存在下的釋放行為進(jìn)行了研究.如圖4所示，無(wú)DTT存在時(shí)，尼羅紅的熒光強(qiáng)度緩慢下降.而DTT存在時(shí)，由于疏水鏈段主鏈中的二硫鍵斷裂，聚合物膠束被破壞，尼羅紅分子被釋放進(jìn)入水溶液中，熒光強(qiáng)度迅速下降，12 h時(shí)熒光強(qiáng)度減小40%左右， 48 h時(shí)熒光強(qiáng)度保持在20%左右.結(jié)果表明，所合成的兩親性三嵌段共聚物mPEG-b-P1a-b-mPEG膠束具有良好的還原響應(yīng)性能，可在還原劑存在時(shí)快速釋放所包載的疏水性藥物.

圖4 DTT存在或不存在時(shí)尼羅紅的還原響應(yīng)釋放行為Fig.4 Reduction-triggered Nile Red release profiles in aqueous solution with and without DTT.

3 結(jié) 論

利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備了具有還原響應(yīng)的兩親性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG，對(duì)其結(jié)構(gòu)、自組裝行為以及還原響應(yīng)性能進(jìn)行了深入的研究.結(jié)果表明，mPEG-b-P1-b-mPEG具有較低的臨界膠束濃度，在水中自組裝形成的球形膠束的平均粒徑為61.3 nm.在DTT存在的條件下，包載在膠束中的尼羅紅可以被快速釋放，48 h時(shí)釋放率可達(dá)80%.這類具有還原響應(yīng)的聚合物膠束有望用作聚合物藥物載體，有效地運(yùn)輸和釋放疏水性藥物.

[1] RYU J H，ROY R，VENTURA J,etal.Redox-sensitive disassembly of amphiphilic copolymer based micelles [J].Langmuir，2010，26(10)：7086-7092.

[2] KOO A N，LEE H J，KIM S E，etal.Disulfide-cross-linked peg-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery [J].Chemical Communications，2008，48(1)：6570-6572.

[3] SUN H，GUO B，LI X，etal.Shell-sheddable micelles based on dextran-ss-poly (ε-caprolactone) diblock copolymer for efficient intracellular release of doxorubicin [J].Biomacromolecules，2010，11(4)：848-854.

[4] TANG L Y，WANG Y C，LI Y，etal.Shell-detachable micelles based on disulfide-linked block copolymer as potential carrier for intracellular drug delivery [J].Bioconcugate Chemistry，2009，20(6)：1095-1099.

[5] WEI R，CHENG L，ZHENG M，etal.Reduction-responsive disassemblable core-cross-linked micelles based on poly(ethylene glycol)-b-poly(n-2-hydroxypropyl methacrylamide)-lipoic acid conjugates for triggered intracellular anticancer drug release [J].Biomacromolecules，2012，13(8)：1525-7797.

[6] LIU X Y，HE J W，HU D，etal.Facile synthesis of a reduction-responsive amphiphilic triblock polymer via a selective thiol-disulfide exchange reaction [J].RSC Advances，2014，4(90)：48897-48900.

[7] LIU X Y，HE J W，NIU Y L，etal.Photo-responsive amphiphilic poly(α-hydroxy acids) with pendent o-nitrobenzyl ester constructed via CuAAC reaction [J].Polymers for Advanced Technologies，2015，26(5)：449-456.

[8] HU D，LI Y F，NIU Y L，etal.Photo-responsive reversible micelles based on azobenzene-modified poly(carbonate)s via azide-alkyne click chemistry[J].RSC Advances，2014，4(89)：47929-47936.

[9] LI Y F，NIU Y L，HU D，etal.Preparation of Light-responsive polyester micelles via ring-opening polymerization of O-carboxyanhydride and azide-alkyne click chemistry [J].Macromolecular Chemistry and Physics，2015，216(1)：77-84.

[10]HU D，PENG H，NIU Y L，etal.Reversibly light-responsive biodegradable poly(carbonate)s micelles constructed via CuAAC reaction [J].Journal of Polymer Science，Part A：Polymer Chemistry，2015，53(6)：750-760.

Synthesis of Reduction-responsive Amphiphilic Copolymer by Thiolene Click Chemistry

LU Yanbing?，XIE Yuanbin，XIA Yingchun

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Hunan University，Changsha 410082,China)

Amphiphilic triblock copolymer mPEG-b-P1-b-mPEG,with disulfide bond in the main chain of the hydrophobic block,was prepared from cystamine dihydrochloride,allyl chloroformate,1,6-hexanedithiol and monomethoxy poly (ethylene glycol) with a thiol end group through thiolene click chemistry method. Self-assembly of the obtained mPEG-b-P1-b-mPEG was further investigated. The results showed that the critical micelle concentration of the amphiphilic block polymer was 0.032 mg/mL,and the average diameter of the micelle was about 61.3 nm. The loaded model drug Nile Red could be released from the micelles in the presence of DTT,indicating the reduction responsiveness of the obtained amphiphilic copolymer. Therefore,these findings suggested the potentials of the amphiphilic copolymers as smart intracellular drug delivery systems.

amphiphilic polymer;thiol-ene click chemistry;reduction responsiveness;micelle；controlled drug deeivery

1674-2974(2017)06-0096-05

10.16339/j.cnki.hdxbzkb.2017.06.016

2016-05-17

盧彥兵(1976—),男，河南鄢陵人，湖南大學(xué)副教授，博士生導(dǎo)師?通迅聯(lián)系人，E-mail:yanbinglu@hnu.edu.cn.

O633.3

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