赤擬谷盜對(duì)4種小麥揮發(fā)物的觸角電位及行為反應(yīng)

董 震，汪中明，張洪清，張 濤，伍 祎，江亞杰，章 妺，林麗莎，曹 陽*

（1．河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2．國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037；3．福建省糧油科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350001）

赤擬谷盜對(duì)4種小麥揮發(fā)物的觸角電位及行為反應(yīng)

董 震1，汪中明2，張洪清2，張 濤2，伍 祎2，江亞杰1，章 妺2，林麗莎3，曹 陽2*

（1．河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2．國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037；3．福建省糧油科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350001）

擬通過觸角電位技術(shù)（EAG）技術(shù)探索利用化學(xué)信息物質(zhì)監(jiān)測防治赤擬谷盜的方法。探索了赤擬谷盜EAG測量過程中的基本操作方法，揭示了其離體觸角EAG反應(yīng)的適應(yīng)性和持續(xù)時(shí)間；利用EAG技術(shù)和四臂嗅覺儀檢測了赤擬谷盜對(duì)4種不同濃度小麥揮發(fā)物的觸角電位及行為反應(yīng)。結(jié)果表明：EAG測量過程中兩次刺激的最小間隔為60 s；30 min內(nèi)EAG值變化幅度約為5%；在一定濃度范圍內(nèi)，赤擬谷盜對(duì)4種小麥揮發(fā)物的EAG反應(yīng)隨揮發(fā)物濃度的增加而增強(qiáng)，但水楊酸甲酯質(zhì)量濃度超過5 μg/μL后赤擬谷盜EAG值開始下降；行為反應(yīng)測試中，苯甲醛表現(xiàn)出對(duì)赤擬谷盜有一定的引誘作用。EAG結(jié)果與行為反應(yīng)有一定的相關(guān)性，但也存在區(qū)別。因此，要確定氣味物質(zhì)對(duì)昆蟲的活性，還需要到實(shí)際環(huán)境中進(jìn)行試驗(yàn)。

赤擬谷盜；小麥揮發(fā)物；EAG；行為反應(yīng)

0 前言

赤擬谷盜（Tribolium castaneum Herbst）屬鞘翅目擬步甲科，是一種重要的世界儲(chǔ)糧害蟲，為害嚴(yán)重[1]。目前，赤擬谷盜防治仍然以PH3熏蒸為主[2]，對(duì)赤擬谷盜危害的監(jiān)測與綜合防治，應(yīng)開展全方位的研究[3]。探索赤擬谷盜和化學(xué)信息物質(zhì)之間的相互作用關(guān)系是尋求防治方法的重要工作[4-5]。植物釋放的揮發(fā)性氣味與昆蟲的定位、取食、繁衍等生活行為息息相關(guān)[6-9]，觸角電位技術(shù)（EAG）是鑒別植物揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)昆蟲有無作用的常用技術(shù)之一，通過觸角電位的有無和大小，可以判斷刺激物對(duì)昆蟲是否有活性和活性強(qiáng)弱，快速準(zhǔn)確地篩選出活性物質(zhì)[10-12]。

農(nóng)業(yè)上應(yīng)用EAG技術(shù)已發(fā)現(xiàn)了許多活性物質(zhì)，如測定小菜蛾時(shí)，六碳醛、青葉醇等能引起小菜蛾較高的觸角電位反應(yīng)，在行為上也表現(xiàn)出對(duì)小菜蛾的吸引[13]。鞘翅目昆蟲對(duì)萜烯類物質(zhì)的觸角電位反應(yīng)較強(qiáng)烈，如松褐天牛雄蟲對(duì)Carene的反應(yīng)最為強(qiáng)烈[14]。此外，測量不同組合、配比及劑量的人工合成性信息素對(duì)棉鈴蟲雄蟲的觸角電位反應(yīng)，對(duì)進(jìn)一步改進(jìn)棉鈴蟲性誘劑的田間應(yīng)用具有指導(dǎo)意義[15]。

赤擬谷盜由于其觸角微?。ú坏? mm）且蟲體堅(jiān)硬，限制了觸角電位技術(shù)在其中的應(yīng)用。作者擬探索赤擬谷盜EAG測量過程中的基本操作方法及條件，揭示其離體觸角EAG反應(yīng)的適應(yīng)性和持續(xù)時(shí)間，為赤擬谷盜EAG的測量提供參考；利用EAG技術(shù)和四臂嗅覺儀檢測赤擬谷盜對(duì)4種不同濃度小麥揮發(fā)物的觸角電位及行為反應(yīng)，對(duì)比分析觸角電位與行為反應(yīng)的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示赤擬谷盜的嗅覺反應(yīng)特點(diǎn)、探索信息物質(zhì)在赤擬谷盜監(jiān)測和綜合防治中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

赤擬谷盜試蟲由國家糧食局科學(xué)研究院提供，人工氣候室內(nèi)連續(xù)多代飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃，光照黑暗比為16∶8。選擇生長發(fā)育一致、羽化后34 d的健康成蟲進(jìn)行觸角電位和行為測試。

1.2 儀器與設(shè)備

常規(guī)用具：移液槍、移液槍頭、小鑷子、毛筆、Kaisaling液、巴斯德管、玻璃毛細(xì)管、濾紙等。

觸角電位儀[16]：荷蘭Syntech公司，主要由5部分組成，即IDAC-4型四通道信號(hào)采集控制器、EAG數(shù)據(jù)記錄及分析軟件、PRG-2型探頭及電極固定器、CS-55型刺激氣流控制器、MP-22型顯微操作臺(tái)；防電磁干擾的法拉第籠：自制；QP-01型四臂嗅覺儀：點(diǎn)將（上海）科技股份有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)化合物

選取4種小麥揮發(fā)物組分[17]：6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO），98%，Merck；順-3-己烯乙酸酯（HA），99%，沃凱；苯甲醛（BD），98%，AR（滬試）；水楊酸甲酯（MS），99%，Sigma。正己烷：98%，AR（京試）。

1.4 觸角電位反應(yīng)測試

1.4.1 測試方法

首先將 20 μL揮發(fā)物溶液滴加在 20 mm×5 mm的濾紙片上，然后將濾紙嵌入巴斯德管中，密閉后置于冰箱中待用。操作過程中，將巴斯德管接氣流控制器，出口正對(duì)觸角并始終保持與觸角相同距離，由氣流控制器提供氣流，流量100 mL/s，刺激時(shí)間為0.4 s，由記錄儀記錄數(shù)據(jù)[18]。測試過程中，首先利用改造過的移液槍頭將參比電極插入赤擬谷盜頭部，玻璃電極內(nèi)充滿Kaisaling液，此時(shí)頭部及觸角離體；然后將觸角端部套在記錄電極中，觸角與記錄電極內(nèi)的Kaisaling液接觸，同時(shí)應(yīng)保證觸角完全暴露在空氣中，尤其是末端膨大的3節(jié)，以保證觸角所有部位均可接受刺激物的刺激。測試時(shí)環(huán)境溫度保持在28℃。1.4.2 觸角EAG適應(yīng)性測定

“無規(guī)矩不可成方圓”。黨中央的“八項(xiàng)規(guī)定”“三嚴(yán)三實(shí)”及“自律準(zhǔn)則”“處分條例”等就是最好的規(guī)矩。千里之堤毀于蟻穴，一些巨貪，往往就是從貪小便宜步步為“盈”“煉”成的。“易魚”類似事件的嚴(yán)肅處理，體現(xiàn)的是“抓早抓小”，防微杜漸，以遏制由量變到質(zhì)變。“好規(guī)矩”需善始善終，嚴(yán)要求產(chǎn)生好成效，嚴(yán)管理養(yǎng)成好習(xí)慣，嚴(yán)標(biāo)準(zhǔn)才能得民心。杜絕“易魚”類似案例發(fā)生，打虎學(xué)武松拳頭要硬的同時(shí)，拍蠅力度亦不能松。

為了確定每兩次刺激的最佳間隔時(shí)間，用20 μL的苯甲醛作為標(biāo)準(zhǔn)刺激物，間隔時(shí)間分別為15、30、60 s，每次處理共刺激5次，重復(fù)3根觸角。每種間隔刺激的EAG反應(yīng)結(jié)果用第一次的測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化[18]，即標(biāo)準(zhǔn)化的×100%。

1.4.3 觸角持續(xù)反應(yīng)時(shí)間測定

為了明確赤擬谷盜觸角接受刺激的持續(xù)反應(yīng)時(shí)間，用20 μL的苯甲醛作為標(biāo)準(zhǔn)刺激物，每間隔15 min刺激1次，共刺激8次，重復(fù)3根觸角。以第1次刺激獲得的EAG反應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)化。比較2 h內(nèi)EAG反應(yīng)的變化[18]。

1.4.4 劑量反應(yīng)

為了明確赤擬谷盜觸角對(duì)不同濃度刺激物的劑量反應(yīng)，對(duì)苯甲醛（BD）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）、水楊酸甲酯（MS）和順-3-己烯乙酸酯（HA）做劑量反應(yīng)。揮發(fā)物質(zhì)量濃度分別為0.005、0.05、0.5、5、50 μg/μL。

1.5 行為反應(yīng)測試

測定時(shí)調(diào)節(jié)氣流速度為370 mL/min,在此速度下四臂嗅覺儀的4個(gè)區(qū)域分界明顯[19]。四臂嗅覺儀進(jìn)氣口連接帶有活性炭的圓底燒瓶，以得到純凈的空氣。選擇對(duì)角的兩個(gè)區(qū)作為處理區(qū)，剩下的兩個(gè)區(qū)域?yàn)閷?duì)照區(qū)，以觸角電位反應(yīng)中反應(yīng)值最高的濃度作為每種反應(yīng)物的測試濃度，在氣味源瓶內(nèi)加入20 μL該濃度待測信息氣味物質(zhì)。每種濃度樣品測試3次，每次測試30頭成蟲。測試5 min后，檢查各誘集瓶內(nèi)（或聯(lián)結(jié)管的進(jìn)口孔）的測試?yán)ハx數(shù)量，計(jì)算誘集率。

2 結(jié)果與分析

2.1 觸角EAG適應(yīng)性測定

赤擬谷盜離體觸角在15、30、60 s時(shí)間間隔下的EAG反應(yīng)如圖1所示。從圖1可以看出，在15 s和30 s時(shí)間間隔下，其EAG反應(yīng)值在第2次重復(fù)刺激時(shí)顯著下降，EAG值下降分別約為40%和20%，赤擬谷盜表現(xiàn)出了對(duì)苯甲醛的反應(yīng)適應(yīng)性。當(dāng)時(shí)間間隔為60 s時(shí)，連續(xù)刺激5次的EAG反應(yīng)值變化很小。因此，選定兩次刺激的最小時(shí)間間隔為60 s。

圖1 赤擬谷盜在3種時(shí)間間隔下的EAG反應(yīng)Fig.1 Nomalized EAG response values of T.castaneum to BD at 3 different time intervals

2.2 觸角持續(xù)反應(yīng)時(shí)間測定

利用赤擬谷盜離體觸角測定EAG，其EAG反應(yīng)值在120 min內(nèi)的變化如圖 2所示?？傮w上看，120 min內(nèi)，EAG總體下降了約 50%。前30 min EAG值變化幅度較小，下降幅度約5%；30～60 min之間，EAG值下降幅度較大；60 min后，EAG值下降幅度較小，但 EAG值維持在較低水平。因此，每個(gè)赤擬谷盜離體觸角的聯(lián)系測量時(shí)間不應(yīng)超過30 min，以保證獲得準(zhǔn)確的測量值。

圖2 赤擬谷盜在120 min內(nèi)的EAG反應(yīng)Fig.2 Nomalized EAG response values of T.castaneum within 120 min

2.3 劑量反應(yīng)

赤擬谷盜對(duì)4種刺激物的劑量反應(yīng)曲線如圖3所示。整體上看，在一定范圍內(nèi)，赤擬谷盜對(duì)4種刺激物的EAG值隨4種刺激物質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)刺激物質(zhì)量濃度較小時(shí)，赤擬谷盜對(duì)4種刺激物的EAG值比較接近，隨著質(zhì)量濃度的增大，赤擬谷盜對(duì)不同種類的刺激物的EAG反應(yīng)值出現(xiàn)了較大差別，隨苯甲醛（BD）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）、和順-3-己烯乙酸酯（HA）質(zhì)量濃度的升高，EAG始終保持上升的趨勢；而當(dāng)水楊酸甲酯質(zhì)量濃度大于5 μg/μL時(shí)，EGA開始下降。

圖3 赤擬谷盜的劑量反應(yīng)曲線Fig.3 EAG dose-dependent curve for T.castaneum

2.4 行為反應(yīng)測試

利用四臂嗅覺儀測試赤擬谷盜對(duì)4種氣味物質(zhì)的行為反應(yīng)，結(jié)果如表1所示。從表1可算出苯甲醛的誘集率為63.33%，t檢驗(yàn)結(jié)果表明苯甲醛的誘集率顯著高于對(duì)照（P＜0.01）；其余3種氣味物質(zhì)與對(duì)照組無顯著性差異。

表1 赤擬谷盜對(duì)4種氣味物質(zhì)的行為反應(yīng)Table 1 Behavioral response of T.castaneum to 4 volatiles

3 討論與結(jié)論

赤擬谷盜觸角與電極的連接是EAG測量的關(guān)鍵，觸角與電極的連接質(zhì)量將直接影響測試信號(hào)的穩(wěn)定性和獲得數(shù)據(jù)的可靠性。赤擬谷盜觸角較小，只有約1 mm，連接難度大，每次連接應(yīng)采取相同的操作方法以保證基本相同的連接質(zhì)量。剛連接好的觸角，獲得的信號(hào)可能不穩(wěn)定，此時(shí)應(yīng)待信號(hào)穩(wěn)定后，方可進(jìn)行測量。

在測量過程中，當(dāng)赤擬谷盜觸角末端膨大的三節(jié)浸入記錄電極內(nèi)的Kaisaling液時(shí)，很難獲得反應(yīng)信號(hào)。因此，赤擬谷盜觸角末端不應(yīng)插入Kaisaling液內(nèi)，但應(yīng)保證觸角與Kaisaling液的接觸，使得觸角獲得刺激物的充分刺激；同時(shí)我們猜測，赤擬谷盜觸角末端膨大的三節(jié)可能聚集了大量的味覺感受器。在以后的測試工作中，還可以用Kaisaling液浸沒赤擬谷盜觸角末端不同的小節(jié)，以分析末端不同的小節(jié)對(duì)物質(zhì)的感受作用。

溫度對(duì)信號(hào)的測量也有影響。室內(nèi)溫度低于25℃時(shí)，有時(shí)將無法獲得測試信號(hào)，室溫28℃更有利于測試的進(jìn)行。未來還應(yīng)進(jìn)行不同溫度下的測量研究，以獲得最佳的測試環(huán)境溫度。

已有的研究表明，昆蟲對(duì)某些化學(xué)信息物質(zhì)的觸角電位反應(yīng)與行為反應(yīng)一致，而對(duì)另外一些化學(xué)信息物質(zhì)的則不相關(guān)甚至負(fù)相關(guān)[20]。本試驗(yàn)中赤擬谷盜對(duì)4種氣味物質(zhì)都表現(xiàn)出了EAG反應(yīng)，但只有苯甲醛對(duì)赤擬谷盜有顯著的引誘效果。因此，要確定氣味物質(zhì)對(duì)昆蟲的活性，還需要到實(shí)際環(huán)境中進(jìn)行試驗(yàn)，因?yàn)閷?shí)際環(huán)境中存在的氣味物質(zhì)更為復(fù)雜，這可能對(duì)所測試的信息物質(zhì)產(chǎn)生干擾[21]。不過，EAG數(shù)據(jù)至少可以表明赤擬谷盜可以檢測到哪些化學(xué)物質(zhì)，這有助于明確赤擬谷盜的嗅覺反應(yīng)特點(diǎn)，更有針對(duì)性地發(fā)掘?qū)Τ鄶M谷盜有生物活性的信息物質(zhì)。

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Abstract：The method of using semiochemicals to monitor and control Tribolium castaneum (Herbst)was investigated by testing its vitro antenna.Meanwhile，the basic operation methods and environmental conditions in the process of the EAG test and the adaptability and duration of EAG response of vitro antennas were also investigated.EAG and behavioral responses of T.castaneum to 4 wheat volatiles and their relationship were tested and analyzed.The results showed that the minimum interval between the two stimuli was 60 s in the EAG test;the change of EAG value within 30 min is about 5%.In a certain concentration range，the EAG and behavioral response values of T.castaneum to 4 volatiles increased with the increase of the concentration of volatiles，but significantly decreased to more than 5 μg/μL of methyl salicylate.In behavior tests，benzaldehyde exhibited certain attraction effects to the insects.There existed certain correlation and difference between the EAG and behavioral response values of T.castaneum to 4 volatiles.Therefore，the bioactivity of volatiles on the insects still need to be further determined in practical environment.

ELECTROANTENNOGRAM(EAG)AND BEHAVIORAL RESPONSES OF TRIBOLIUM CASTANEUM(HERBST)TO 4 WHEAT VOLATILES

DONG Zhen1，WANG Zhongming2，ZHANG Hongqing2，ZHANG Tao2，WU Yi2，JIANG Yajie1，ZHANG Mo2，LIN Lisha3，CAO Yang2
（1.School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Academy of State Administration of Grain， Beijing 100037，China；3.Fujian Research Institute of Cereal and Oil Science and Technology，F(xiàn)uzhou 350025，China）

Tribolium castaneum(Herbst)；wheat volatiles；EAG；behavioral response

TS210

B

1673-2383(2017)03-0056-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.020.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-6-21 10:50:46

2016-10-07

國家國際科技合作項(xiàng)目（2013DFA31960）；國家糧食公益專項(xiàng)（201513002-01）

董震（1989—），男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治。

*通信作者