李若昀,張國治,黃紀(jì)念,蘆 鑫,張問夕,楊 帆
(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所,河南 鄭州 450002;3.天津利金糧油股份有限公司,天津 300112)
芝麻11S蛋白制備方法及結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究
李若昀1,2,張國治1*,黃紀(jì)念2,蘆 鑫2,張問夕3,楊 帆2
(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所,河南 鄭州 450002;3.天津利金糧油股份有限公司,天津 300112)
以脫脂亞臨界芝麻餅粕為原料,考察鹽析法、堿溶超濾酸沉法、堿溶鹽析法、堿溶超濾鹽析法制備芝麻11S蛋白的效果,并分析芝麻11S蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。結(jié)果表明:堿溶超濾鹽析法適宜分離提取芝麻11S蛋白,其提取率和蛋白純度較高(分別為75.47%和83.18%),且酸堿亞基比例與原料中11S蛋白基本一致。與芝麻蛋白相比,芝麻11S蛋白的氨基酸組成存在一定差異,側(cè)鏈氨基酸含量高;二級結(jié)構(gòu)基本相似,但β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和β-反平行含量稍高;表面疏水性強(qiáng);吸水性、乳化性、泡沫穩(wěn)定性差。
芝麻11S蛋白;超濾;功能性質(zhì)
芝麻(Sesame)屬胡麻科胡麻屬,生長在亞熱帶及熱帶地區(qū),一年生油籽作物,營養(yǎng)價值高,富含油脂和蛋白質(zhì),其中蛋白含量達(dá)到20%~25%。芝麻蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白,具有較好的功能特性和較高的營養(yǎng)價值[1-2]。芝麻蛋白主要由2S、7S和11S蛋白組成,其中芝麻11S蛋白是芝麻蛋白的主體,占60%左右,因此研究芝麻11S蛋白對深入了解芝麻蛋白功能性質(zhì)與加工應(yīng)用有積極意義[3-4]。
目前芝麻11S蛋白常用的提取方法是鹽析與層析。研究發(fā)現(xiàn),30%的硫酸銨飽和度適宜芝麻11S蛋白的分離,但是鹽析獲得的芝麻11S蛋白純度低;瓊脂糖凝膠柱層析可以較好地分離純化芝麻2S、7S、11S蛋白,但是該方法樣品處理量小、分離時間長、后續(xù)仍需濃縮脫鹽[3,5]。因此,芝麻11S蛋白的分離方法有待改進(jìn)。
膜分離是利用膜的選擇性分離實現(xiàn)料液的不同組分的分離、純化和濃縮,能較好保持生物大分子活性。超濾是膜分離的重要分支,適宜蛋白、多糖等生物高分子的分離濃縮,已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于生物工程、制藥、食品、水處理、化工等領(lǐng)域[6]。作者采用超濾結(jié)合鹽析工藝制備芝麻11S蛋白,考察其產(chǎn)率、亞基組成、氨基酸含量,以期建立一種高效制備芝麻11S蛋白的方法;此外,初步分析其結(jié)構(gòu)功能性質(zhì),以便為芝麻11S蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)。
1.1 材料和試劑
亞臨界脫脂芝麻粕:各組分含量為蛋白質(zhì)(32.94±0.35)%、脂肪(5.23±0.45)%、水分(4.96±0.08)%、灰分(11.64±0.28)%,由河南省農(nóng)科院提供。
TRIS、丙烯酰胺、N,N’-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉 (SDS)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED):均為電泳純,美國 Amresco公司。
1.2 主要儀器與設(shè)備
CTXNW-10B超聲循環(huán)提取機(jī):北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司;DMJ60-3三級納濾膜過濾系統(tǒng):濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司;LYOVAC GT1冷凍干燥機(jī):德國SRK系統(tǒng)技術(shù)有限公司;K-05型自動定氮儀:上海晟聲自動化分析儀器有限公司;DYY-12型電泳儀電源、DYCZ-24DN型電泳儀:北京六一儀器廠;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng):美國伯樂BIO-RAD公司;熒光光譜儀:Agilent Technologies公司;FW-4A型粉末壓片機(jī):天津市拓普儀器有限公司;傅里葉紅外光譜儀:Nicolet IS5賽默飛世爾科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 芝麻11S蛋白的制備
1.3.1.1 鹽析法提取11S蛋白(SOG)
參考Allaoua Achouri等[7]的方法,脫脂芝麻粕與1 mol/L NaCl,pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液按料液比1∶10混合,25 ℃下攪拌 2 h,5 000 r/min離心 40 min,上清液抽濾,測體積,冰浴加入硫酸銨達(dá)到30%飽和度,4℃靜置過夜,4℃下12 000 r/min離心15 min,沉淀透析,冷凍干燥,得到芝麻11S蛋白粗提物。
1.3.1.2 堿溶超濾酸沉法提取11S蛋白(AUAG)
脫脂芝麻粕與蒸餾水按料液比1∶20混合,40℃,pH 至 10.5,攪拌 40 min,5 000 r/min離心 30 min,上清液采用截留分子質(zhì)量25 ku膜超濾,截留液調(diào) pH 至 4.4,過夜,5 000 r/min離心 30 min,沉淀透析,冷凍干燥,得到芝麻11S蛋白粗提物。
1.3.1.3 堿溶鹽析法提取11S蛋白(ASG)
一次離心(ASG-Ⅰ):脫脂芝麻粕與1 mol/L NaCl按料液比 1∶18混合,40 ℃,pH 10.5,攪拌 40 min,調(diào)節(jié) pH 至 7.5,5 000 r/min離心 40 min,上清液抽濾,測體積,冰浴加入硫酸銨達(dá)到30%飽和度,4℃靜置過夜,8 000 r/min離心15 min,沉淀透析,冷凍干燥,得到芝麻11S蛋白粗提物。
兩次離心(ASG-Ⅱ):脫脂芝麻粕與1 mol/L NaCl按料液比 1∶18混合,40 ℃,pH 10.5,攪拌 40 min,5 000 r/min離心 30 min,上清液調(diào)pH至7.5,再次5 000 r/min離心40 min,上清液抽濾,測體積,冰浴加入硫酸銨達(dá)到30%飽和度,4℃靜置過夜,8 000 r/min離心15 min,沉淀透析,冷凍干燥,得到芝麻11S蛋白粗提物。
1.3.1.4 堿溶超濾鹽析法提取11S蛋白(AUSG)
脫脂芝麻粕與1 mol/L NaCl按料液比1∶20混合,40 ℃,pH 10.5,攪拌 60 min,5 000 r/min離心30 min,上清液采用截留分子質(zhì)量25 ku膜超濾,截留液調(diào)pH至7.5,5 000 r/min離心30 min,測上清液體積,冰浴加入硫酸銨達(dá)到30%飽和度,4℃靜置過夜,5 000 r/min離心30 min,沉淀透析,冷凍干燥,得到芝麻11S蛋白粗提物。
1.3.2 提取蛋白成分分析
水分含量測定參照GB/T 5009.3—2010;灰分含量測定參照GB/T 5009.4—2010;粗蛋白含量測定參照GB/T 5009.5—2010;氨基酸分析參照GB 5009.124—2003。
1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳
參考Achouri等[5]的方法,采用3%濃縮膠(pH 6.8)和 12%分離膠(pH 8.8),上樣量 5 μL,電壓220 V,濃縮膠電流16 mA,分離膠電流28 mA,染色1~2 h,脫色3次(每次40 min以上),最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像處理。
1.3.4 蛋白功能特性分析
1.3.4.1 吸水性測定[8]
吸水性(g/g)=(W2-W1)/W0,
式中:W0為稱取的蛋白質(zhì)量(g);W1為吸水前總質(zhì)量(g);W2為吸水后總質(zhì)量(g)。
1.3.4.2 吸油性測定[9]
吸油性(g/g)=(W2-W1)/W0,
式中:W0為稱取的蛋白質(zhì)量(g);W1為吸油前總質(zhì)量(g);W2為吸油后總質(zhì)量(g)。
1.3.4.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定[10]
稱取3 g蛋白樣品,加50 mL蒸餾水,pH 7.0,加入50 mL大豆油,10 000 r/min均質(zhì) 2 min,1 500 r/min 離心 5 min。記錄乳化層高度(H0),管中液體總高度(H)。乳化性(EA)=H0/H。
將上述乳化樣品置于50℃水浴加熱30 min,冷卻至室溫。1 500 r/min離心5 min。記錄乳化層高度(H1),管中液體總高度(H2)。乳化穩(wěn)定性(ES)=H1/H2。
1.3.4.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定[11]
稱取1 g蛋白樣品,加50 mL蒸餾水并調(diào)節(jié)pH至 7.0,12 000 r/min攪打2 min。記錄泡沫體積(V0),總體積(V)。起泡性(FC)=V0/V。
將上述溶液室溫靜置30 min后,記錄泡沫體積(V1)。泡沫穩(wěn)定性(FS)=V1/V0。
1.3.4.5 氮溶解指數(shù)的測定
分別稱取0.5 g芝麻蛋白、芝麻11S蛋白,調(diào)節(jié)pH值為3~10,30℃水浴振蕩 1 h,8 000 r/min離心20 min,采用凱氏定氮法測定上清液中可溶性氮含量。
NSI(%)=(N1/N)×100,
式中:N1為可溶性氮質(zhì)量(g),N為樣品中總氮質(zhì)量(g)。
1.3.4.6 紅外光譜測定
蛋白樣品與溴化鉀混勻研磨壓片,波長掃描范圍為400~4 000 cm-1,掃描次數(shù)64,分辨率 4 cm-1,光譜數(shù)據(jù)用Origin8.5軟件進(jìn)行分析。
1.3.4.7 蛋白質(zhì)表面疏水性測定
激發(fā)波長365 nm,發(fā)射波長484 nm,測定其熒光強(qiáng)度(FI)。以熒光強(qiáng)度對一定質(zhì)量濃度梯度的蛋白質(zhì)溶液(0.005~0.5 mg/mL)作圖,初始段的斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水值。
2.1 各種提取方法制備芝麻11S蛋白的效率與成分分析
由表1可以看出:5種提取方法所得芝麻11S蛋白灰分含量差異性較為顯著,AUSG法提取的芝麻11S蛋白含量和產(chǎn)率比其他方法高,可見其提取效果好;另外,單獨(dú)使用鹽析或截留的方法蛋白提取效果并不理想,但將兩者結(jié)合起來蛋白提取結(jié)果較好;雖然ASG-II法可以提高蛋白純度,但是蛋白提取率下降,且增加操作次數(shù),不值得推薦。
表1 不同方法制備芝麻11S蛋白的提取率及成分分析Table 1 Extraction yield and composition analysis of sesame 11S prtein with different preparation methods%
2.2 芝麻11S蛋白的SDS-PAGE電泳分析
不同提取方法獲得的芝麻11S蛋白電泳圖見圖1,結(jié)果分析見表2。
由表2可以看出:SOG采用硫酸銨鹽析進(jìn)行純化,2S蛋白殘留量較多;AUAG采用堿提后,用膜分離進(jìn)行純化,雖然除去部分小分子蛋白,但2S蛋白殘留量依然較高;ASG在堿提時,體系中的氯化鈉對芝麻蛋白進(jìn)行了一步分離,隨后采用硫酸銨進(jìn)行鹽析,又再次除去雜質(zhì),因此芝麻11S蛋白的比例有所上升;AUSG依次使用氯化鈉、膜過濾和硫酸銨進(jìn)行分離純化,所以純度較高,而且酸堿亞基含量比值為1.64,相對于其他4種方法最接近原料蛋白中11S蛋白的酸堿亞基含量比值(1.61),基本未改變芝麻11S蛋白組成。證明堿溶超濾鹽析法最適宜于分離芝麻11S蛋白。
綜合以上結(jié)果,以堿溶超濾鹽析法制備11S蛋白,研究其氨基酸組成、蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)。
2.3 芝麻11S蛋白與芝麻蛋白的氨基酸組成對比分析
由表3可以看出:芝麻11S蛋白氨基酸組成與芝麻蛋白的氨基酸組成存在一定差異,其中丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、組氨酸、精氨酸含量高于芝麻蛋白。同時,由于半胱氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸含量高,芝麻11S蛋白具有較好的營養(yǎng)價值。
圖1 不同提取方法獲得的芝麻11S蛋白電泳圖Fig.1 Electrophoresis figure of sesame 11S prtein with different preparation methods
表2 芝麻11S蛋白電泳結(jié)果分析Table 2 Electrophoresis results analysis of sesame 11S prtein with different preparation methods %
表3 氨基酸組成分析Table 3 Amino acid compositions analysis g/100g
2.4 芝麻11S蛋白與芝麻蛋白的功能性質(zhì)對比分析
由表4可以看出:芝麻11S蛋白的各種功能性質(zhì)參數(shù)與芝麻蛋白相比差異小,其中芝麻11S蛋白吸水性略有降低,這是因為芝麻11S蛋白是堿溶性蛋白,在中性條件下溶解度較低,其吸水性也由此變小,同時受蛋白質(zhì)含量、流動性、疏水性、顆粒表面性質(zhì)的影響,吸油性也會有所不同[12]。蛋白質(zhì)的乳化性受分子的柔順性、蛋白的溶解度等條件的影響,其中蛋白的溶解度是比較重要的影響因素,溶解度越低,相應(yīng)的乳化性也就越差,同樣受蛋白溶解度的影響,芝麻11S蛋白的起泡性比芝麻蛋白低,泡沫的黏度不高,泡沫間結(jié)合力小,穩(wěn)定性也較差。
2.5 氮溶解指數(shù)測定結(jié)果分析
蛋白溶解性隨pH變化曲線見圖2。在pH 3~10范圍內(nèi),芝麻蛋白和芝麻11S蛋白的溶解性變化趨勢相似,均隨著pH值的增大先降低后升高,在pH 4~5溶解性較低,在pH 3、pH 8~10溶解性較高,且在pH值為10時溶解度達(dá)到最大值(芝麻蛋白溶解度為84.51%,芝麻11S蛋白溶解度為96.95%)。這一變化趨勢與Achouri等[5]報道的相一致,在pH 4~5達(dá)到等電點(diǎn),蛋白質(zhì)分子間相互作用力減弱,蛋白顆粒相互碰撞凝聚產(chǎn)生沉淀。在pH 3、pH 8~10環(huán)境下,蛋白質(zhì)分子帶有電荷,在靜電力的作用下,其顆粒不易聚集,分散在溶液中,蛋白溶解性也因此提高。由圖2還可看出,在pH 3~4和pH 8~10,芝麻11S蛋白的溶解性高于芝麻蛋白,究其原因可能為,芝麻蛋白中的2S蛋白為水溶性蛋白,使芝麻蛋白在一系列pH環(huán)境中保有一定的溶解性,而芝麻11S蛋白為堿溶性蛋白,只有在達(dá)到一定pH值時才能表現(xiàn)出較好的溶解性。
表4 芝麻蛋白功能性質(zhì)分析Table 4 Functional properties analysis of sesame protein
2.6 紅外光譜結(jié)果分析
圖2 蛋白溶解性隨pH變化曲線Fig.2 The changes curve of protein solubility with pH
芝麻蛋白與芝麻11S蛋白紅外掃描圖見圖3。紅外光譜酰胺Ⅰ帶 1 600~1 700 cm-1范圍是二級結(jié)構(gòu)的敏感區(qū)域,是計算蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要譜帶。參考He等[13]的分析方法對擬合圖譜進(jìn)行分析,按照 α-螺旋 (1 650-1 660 cm-1)、β-折疊(1 610-1 642 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 660-1 680 cm-1)、β-反平行(1 680-1 700 cm-1)、無規(guī)卷曲(1 642-1 650 cm-1)的二級結(jié)構(gòu)指認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)得到表5。
通過擬合發(fā)現(xiàn),芝麻11S蛋白與芝麻蛋白二級結(jié)構(gòu)組成相似,主要由β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋組成,這驗證了芝麻蛋白主要由芝麻11S蛋白組成的事實。芝麻11S蛋白的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和β-反平行含量高,且無規(guī)卷曲含量低,可能是造成芝麻11S蛋白在水中溶解性差的原因之一。
圖3 芝麻蛋白與芝麻11S蛋白紅外掃描圖Fig.3 Infrared scan of sesame protein and sesame 11S prtein
圖4 蛋白表面疏水性測定結(jié)果Fig.4 Detection of surface hydrophobicity of protein
表5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組成分析Table 5 Protein secondary structure analysis %
2.7 表面疏水性結(jié)果分析
蛋白表面疏水性測定結(jié)果見圖4。在pH 7時,芝麻11S蛋白的表面疏水性為1 228.1,芝麻蛋白的表面疏水性為920.9,芝麻11S蛋白的表面疏水性大于芝麻蛋白。根據(jù)Kato等[14]的研究,蛋白質(zhì)的表面疏水性與α-螺旋結(jié)構(gòu)呈負(fù)相關(guān),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子內(nèi)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低時,暴露出的分子內(nèi)部隱藏的疏水位點(diǎn)增多,蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出的表面疏水性更強(qiáng),這與芝麻11S蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低而表面疏水性增強(qiáng)的變化趨勢是一致的。
通過對5種不同分離提取芝麻11S蛋白的方法進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn),堿溶超濾鹽析法的蛋白提取率和蛋白純度高 (分別達(dá)到75.47%和83.18%),同時其酸堿亞基比例更接近天然蛋白,因此堿溶超濾鹽析法是適宜的芝麻11S蛋白制備方法。對芝麻11S蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),芝麻11S蛋白與芝麻蛋白的氨基酸組成存在差異,其側(cè)鏈氨基酸殘基含量高;芝麻11S蛋白二級結(jié)構(gòu)基本與芝麻蛋白相似,主要由β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和β-反平行等有序結(jié)構(gòu)組成;11S蛋白吸水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性與芝麻蛋白相比有所降低,吸油性有所升高,氮溶解指數(shù)在堿性條件下高于芝麻蛋白。本文雖然對芝麻11S蛋白的分離提取方法和蛋白結(jié)構(gòu)功能及性質(zhì)進(jìn)行了探究,但芝麻11S蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的關(guān)系、芝麻11S蛋白的生物活性及酶解特性尚未涉及,仍需開展后續(xù)研究。
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THE PREPARATION AND STRUCTURE PROPERTY OF SESAME 11S PROTEIN
LI Ruoyun1,2, ZHANG Guozhi1, HUANG Jinian2, LU Xin2, ZHANG Wenxi3, YANG Fan2
(1.School of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China ;2.Institute of Agricultural Products Processing, Henan Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450002,China;3.Tianjin Lijin Grain and Oil Co.,Ltd.,Tianjin 300112,China)
Sesame protein is a kind of high quality plant protein,which has good functional properties and nutritional value.Sesame protein is mainly composed of 2S,7S and 11S protein,while sesame 11S protein is the main component of sesame protein accounting for 60%.In the present study,defatted sesame cake deriving from subcritical extraction was used as raw material,the performance of preparation of sesame 11S protein by salting out,combination of alkali extraction and salting out,combination of alkali extraction,ultra-filtration and acid precipitation and combination of alkali extraction,ultra-filtration and salting out was investigated,and the structure and property of sesame 11S protein were also analyzed.Results showed that the method of combination of alkali extraction,ultra-filtration and salting-out was most suitable for sesame 11S protein preparation and the yield and purity of products were higher than other methods,which were 75.47%and 83.18%,respectively.The afforded 11S protein had the same acid subunits to alkali subunits ratio with the raw material.Sesame 11S protein showed some difference on the amino acid compositions with sesame protein,especially the amino acid content on the side-chain of 11S protein was higher than sesame protein.There was no significant difference in secondary structure between sesame protein and sesame 11S protein ,but the contents of β-sheet,β-turn,β-antiparallel in sesame 11S protein were slightly higher.Furthermore,sesame 11S protein exhibited the stronger surface hydrophobicity than sesame protein,while its water holding capacity,emulsifying capacity,foam stability were weaker than those of sesame protein.
sesame 11S protein;ultra-filtration;functional properties
TS229
B
1673-2383(2017)03-0006-06
http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.004.html
網(wǎng)絡(luò)出版時間:2017-6-21 10:50:18
2016-09-06
河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金項目
李若昀(1992—),女,山西高平人,碩士研究生,研究方向為食品科學(xué)與工程。
*通信作者