海參內(nèi)臟酶解制備海參肽工藝

楊東達(dá)， 秦洪， 黃雅燕， 葉 靜， 張學(xué)勤， 肖美添

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門(mén) 361021)

海參內(nèi)臟酶解制備海參肽工藝

楊東達(dá)， 秦洪， 黃雅燕， 葉 靜， 張學(xué)勤， 肖美添

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門(mén) 361021)

以蛋白水解度和酶解液中海參肽相對(duì)分子質(zhì)量的分布作為指標(biāo)，考察不同蛋白酶的酶解效果，篩選水解海參內(nèi)臟的最適合蛋白酶，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：胰蛋白酶的水解效果最佳，可用于水解海參內(nèi)臟制備海參肽；在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，加酶量為0.375 1 mkat·g-1，pH值為8.0，酶解溫度為37 ℃，水解時(shí)間為5 h的最優(yōu)酶解條件下，海參內(nèi)臟的水解度可達(dá)到48.90%，酶解液中的多肽(2 000～5 000 u)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.68%，寡肽(含氨基酸)(≤2 000 u)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.25%. 關(guān)鍵詞： 海參肽； 海參內(nèi)臟； 胰蛋白酶； 酶解法； 水解度

海參中的蛋白質(zhì)是其重要的營(yíng)養(yǎng)成分，并且含有甘氨酸、谷氨酸、天門(mén)冬氨酸等近20種氨基酸，且多為人體必需氨基酸[1].生物代謝實(shí)驗(yàn)[2]已經(jīng)證明，大部分蛋白質(zhì)是通過(guò)多肽形式被人體吸收.海參肽的提取方法主要有水解法和酶解法.但由于水解法主要是利用酸或者堿水解蛋白質(zhì)，其反應(yīng)條件劇烈，嚴(yán)重破壞海參肽的結(jié)構(gòu)，而且強(qiáng)酸、強(qiáng)堿容易腐蝕設(shè)備，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求高，因此，酶解法成為近年來(lái)制備海參肽的主要方法.目前，海參肽大多是由海參體壁酶解制得，而海參價(jià)格昂貴，提取成本高.我國(guó)海參年產(chǎn)量超過(guò)14 萬(wàn)t[3],在海參加工過(guò)程中，大量的海參內(nèi)臟被廢棄，造成海洋生物資源的極大浪費(fèi),這些被廢棄的海參內(nèi)臟是制備海參肽和海參多糖等活性組分的良好原料.據(jù)報(bào)道,海參內(nèi)臟中含有豐富的蛋白、多糖、脂肪、皂苷等營(yíng)養(yǎng)成分[4-5]，具有延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗疲勞、抗凝血等活性[6-7]，但有關(guān)海參內(nèi)臟制備海參肽鮮有報(bào)道.因此,本文以海參內(nèi)臟為原料，采用酶法制備海參肽，以蛋白水解度和酶解液中海參肽相對(duì)分子質(zhì)量分布為指標(biāo)，篩選合適的蛋白酶，并優(yōu)化其酶解工藝.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

1) 材料.實(shí)驗(yàn)的海參內(nèi)臟均為刺參(Stichopusjaponicas)，產(chǎn)地為福建霞浦；中性蛋白酶(1.667 mkat·g-1)、堿性蛋白酶(3.334 mkat·g-1)、胰蛋白酶(4.167 mkat·g-1)、木瓜蛋白酶(1.667 mkat·g-1)、菠蘿蛋白酶(8.335 mkat·g-1)，均購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；已知相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)的標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C(12 500)，胰蛋白酶抑制劑(6 511.44)，桿菌肽(1 422.69)，Val-Tyr-Val(379.5)，Gly-Tyr(238.2),均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；乙腈,三氟乙酸，色譜純；超純水；其他試劑均為分析純.

2) 儀器.精密pH計(jì)(美國(guó)奧豪斯儀器有限公司)，Waters 1515型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，TSK凝膠滲透色譜柱(SRT SEC-100，Φ7.8 mm×300 mm，江蘇蘇州賽分科技有限公司),DK-S12型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司),TG6-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 海參內(nèi)臟酶解最佳蛋白酶的篩選 準(zhǔn)確稱取一定量的海參內(nèi)臟粉于反應(yīng)器中，加入100 mL的蒸餾水，在不同蛋白酶最適pH值和溫度條件下，分別向一定量底物溶液中加入中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶，加酶量0.200 mkat·g-1，酶解5 h，取出煮沸5 min，冷卻，離心(4 000 r·min-1，20 min).取上清液定容至100 mL，測(cè)定其可溶性多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水解度，并根據(jù)水解度及酶解液中海參肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布篩選最適蛋白酶.

1.2.3 最佳蛋白酶單因素酶解實(shí)驗(yàn) 以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、加酶量為0.375 1 mkat·g-1、酶解溫度為37 ℃、酶解時(shí)間為5 h為單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)條件，以水解度為指標(biāo)，分別考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響.

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合考慮各因素對(duì)水解度的影響， 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)和加酶量(D)等4個(gè)因素，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)對(duì)海參內(nèi)臟酶解條件進(jìn)行優(yōu)化.表1為正交試驗(yàn)因素水平表.表1中：w(底物)為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；ρ為加酶量；θ為酶解溫度；t為酶解時(shí)間.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 分析方法

1.3.1 海參內(nèi)臟基本質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 分別采用GB/T 5009.3-2003中的質(zhì)量法[8],GB/T 5009.6-2003中的索氏提取法[9],GB/T 5009.4-2010中的馬弗爐高溫灰化法[10],GB/T 5009.5-2010中的微量凱氏定氮法[11]和GB/T 5009.8-2008中的酸水解[12]測(cè)定海參內(nèi)臟的水分、脂肪、灰分、總蛋白和總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.3.2 可溶性多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 采用Folin-酚試劑法[13]測(cè)定，取酶解液，定容至100 mL量瓶，取5.0 mL溶液，并加入5.0 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，混合振蕩，離心(4 000 r·min-1，20 min)；取上清液1.0 mL溶液，加入5.0 mL的福林酚試劑甲液，混勻，于30 ℃下放置10 min；然后，加入0.5 mL福林酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在30 ℃下保溫30 min.以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白試管中的溶液為空白，在650 nm下測(cè)定吸光度值(D(650))，代入由牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中,即可求得可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

隨著武器裝備信息化建設(shè)和成體系發(fā)展的逐步深入，僅使用單一組織或功能的嵌入式仿真訓(xùn)練器很難滿足現(xiàn)有武器裝備的訓(xùn)練需求。因此，大型武器裝備系統(tǒng)通常由不同功能的分布嵌入式裝備仿真器通過(guò)既定的標(biāo)準(zhǔn)集結(jié)互聯(lián)而成。目前廣泛使用的既定標(biāo)準(zhǔn)就是HLA/RTI系統(tǒng)架構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，如圖5所示。

1.3.4 酶解液中海參肽相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定 采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定海參肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布.參照黃雅燕等[15]的方法并略作改進(jìn)，即色譜柱為SRTSEC-100，Φ7.8mm×300mm，流動(dòng)相為乙腈∶水∶三氟乙酸(體積比為20.0∶80.0∶0.1)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，流速為0.5mL·min-1，進(jìn)樣量為10μL，柱溫為30 ℃.

以不同相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo)，以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)lgMr為縱坐標(biāo)，繪制Rt-lgMr標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)分子質(zhì)量校正的線性回歸方程為lgMr=4.97-0.078×Rt，R2=0.995 5.取酶解液適量，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行色譜分析，計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量，并采用峰面積歸一法計(jì)算海參肽相對(duì)分子質(zhì)量的分布情況.

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及分析 采用Origin9.0和SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 海參內(nèi)臟基本組成

海參內(nèi)臟基本組成，如表2所示.由表2可知：洗凈干燥后的海參內(nèi)臟中，總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，占總質(zhì)量的59.50%，其次為灰分和粗脂肪.因此，海參內(nèi)臟可以做為制備海參肽良好的蛋白來(lái)源.

表2 海參內(nèi)臟中主要化學(xué)成分Tab.2 Main chemical compositions of sea cucumber

2.2 蛋白酶水解海參內(nèi)臟效果

不同蛋白酶水解海參內(nèi)臟效果的比較，如表3所示.由表3可知：堿性蛋白酶水解度最大，其次為胰蛋白酶和中性蛋白酶，但3種蛋白酶水解度相差不大，因此，進(jìn)一步比較海參肽中相對(duì)分子質(zhì)量分布，作為判斷酶解效果優(yōu)劣的指；胰蛋白酶酶解液中寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，風(fēng)味蛋白酶次之.

表3 蛋白酶酶解效果的比較Tab.3 Enzymolysis effect comparison of proteases

圖1 胰蛋白酶酶解液的液相色譜圖Fig.1 HPLC diagram of trypsin hydrolysate

胰蛋白酶酶解液中多肽和寡肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布，如圖1所示.由圖1可知：相對(duì)分子質(zhì)量≤2 000 u的寡肽(含氨基酸)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.25%，而相對(duì)分子質(zhì)量為2 000～5 000 u的多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.68%.因此，綜合考慮海參內(nèi)臟的水解度及海參肽中相對(duì)分子質(zhì)量分布，選擇胰蛋白酶作為最佳水解用酶.

2.3 胰蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

按照酶解工藝，以蛋白水解度為指標(biāo)，考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響，如圖2所示.由圖2可知：各個(gè)因素對(duì)酶解過(guò)程都有一定程度的影響，經(jīng)優(yōu)化，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，加酶量為0.375 1 mkat·g-1，溫度為37 ℃，時(shí)間為5 h是胰蛋白酶酶解海參內(nèi)臟的最佳條件.

(a) 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) (b) 加酶量

(c) 酶解溫度 (d) 酶解時(shí)間圖2 酶解條件對(duì)水解度的影響Fig.2 Influence of enzymolysis conditions on degree of hydrolysis

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

正交試驗(yàn)結(jié)果和極差、方差分析表，分別如表4,5所示.由表4可知：各因素對(duì)胰蛋白酶水解度的影響的大小順序?yàn)锳>D>B>C，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)>加酶量>溫度>時(shí)間.其中，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度的影響呈極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，加酶量對(duì)水解度的影響呈具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，溫度對(duì)水解度的影響不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是考慮到溫度是影響酶活的重要因素，因此，溫度選擇37 ℃.最優(yōu)條件為A2B2C2D2，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，加酶量為0.375 1 mkat·g-1，溫度為37 ℃，時(shí)間為5 h.

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.4 Result of orthogonal experiment and analysis of difference

進(jìn)一步在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，其水解度分別為48.63%，48.90%，49.16%.這說(shuō)明通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，可以用于海參內(nèi)臟的酶解制備海參多肽.

表5 正交設(shè)計(jì)方差分析表Tab.5 Variance analysis of orthogonal experiment

“*”表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；“**”表示極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

3 討論

蛋白質(zhì)為刺參的主要營(yíng)養(yǎng)成分，占體壁總質(zhì)量的70%以上，刺參內(nèi)臟中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)亦較高.劉小芳等[16]對(duì)乳山刺參體壁和內(nèi)臟基本營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了分析，其中，刺參內(nèi)臟蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總質(zhì)量的34.90%.實(shí)驗(yàn)對(duì)海參內(nèi)臟基本組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，占總質(zhì)量的59.50%，但脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，占總質(zhì)量的7.64%，可見(jiàn)海參內(nèi)臟是制備高活性海參肽的良好資源.

采用的胰蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，能消化溶解變性的蛋白質(zhì)，它作用于多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)端，是酶解蛋白質(zhì)中常用的蛋白酶.龔麗芬等[17]采用胰蛋白酶酶解文蛤，并測(cè)定了氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明胰蛋白酶酶解的文蛤提取液中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于熱水提取法的質(zhì)量分?jǐn)?shù).王金水等[18]研究了胰蛋白酶水解谷朊粉得到的的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，其還原力為0.81，說(shuō)明其酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化能力.施文衛(wèi)等[19]通過(guò)胰蛋白酶制備鷹嘴豆活性肽，具有較好的抗氧化活性，所得酶解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為67.59%.

另外，由于蛋白酶的切割位點(diǎn)不同，采用不同的蛋白酶水解，其水解度存在一定的差異.如周潔靜等[20]采用木瓜蛋白酶酶解海參腸制備海參肽，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，在最佳水解條件下，水解度達(dá)到42.2%.劉程惠等[21]通過(guò)胰蛋白酶水解海參，在最佳酶解條件下，其水解度達(dá)到32.93%.Yan等[22]以水解度為指標(biāo)，篩選了多種蛋白酶酶解海參內(nèi)臟，結(jié)果表明，胰蛋白酶酶解效果最佳，水解度達(dá)到32.38%.袁坤山等[23]采用復(fù)合蛋白酶酶解糙刺參內(nèi)臟制備海參肽，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，在最佳水解條件下，水解度達(dá)到49.32%，與文中的水解度相差不大.

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，海參肽的制備一般僅以水解度作為指標(biāo)評(píng)價(jià)酶解效果，而海參肽的生物活性與其相對(duì)分子質(zhì)量是息息相關(guān)的.相對(duì)分子質(zhì)量在2 000 u以下的寡肽主要是通過(guò)食物中的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)特定的酶水解獲得，食用后可以避免腸道酶的水解消化而直接進(jìn)入小腸被吸收，提高了胃腸對(duì)多肽和氨基酸的吸收速率[2].王靜等[24]以海參中蛋白酶使其機(jī)體自溶，通過(guò)超濾進(jìn)行分級(jí)分離并研究其抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分子質(zhì)量在3 000 u以下的海參肽，其抗氧化活性最強(qiáng).袁坤山等[25]利用木瓜蛋白酶酶解糙刺參內(nèi)臟，酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量在2 000 u以下的組分占總質(zhì)量的99.52%，500 u以下的組分所占比例則為80.00%，其Vc抗氧化活性當(dāng)量值(VcEAC)為44.95 mg·g-1，說(shuō)明所得糙刺參內(nèi)臟蛋白酶解物具有較高的抗氧化活性.此外，通過(guò)酶法制得的海參肽還具有其余的生物活性.袁文鵬等[26]測(cè)定仿刺參腸水解液對(duì)小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)的影響，結(jié)果顯示能夠明顯延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，說(shuō)明仿刺參腸水解液具有顯著的抗疲勞活性.

以實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的酶解工藝制得的海參內(nèi)臟酶解液中多肽(2 000～5 000 u)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.68%，寡肽(含氨基酸)(≤2 000 u)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.25%，提示制備所得的海參肽可能具有多種生物活性，有關(guān)海參肽的生物活性與相對(duì)分子質(zhì)量關(guān)系有待進(jìn)一步研究.

文中對(duì)海參內(nèi)臟酶法制備海參肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了胰蛋白酶對(duì)海參內(nèi)臟的酶解工藝.其最佳的酶解條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，加酶量為0.375 1 mkat·g-1，溫度為37 ℃，酶解時(shí)間為5 h，pH值為8.0.在此最優(yōu)條件下，海參內(nèi)臟的水解度為48.90%，酶解液中相對(duì)分子質(zhì)量在2 000 u以下的寡肽(含氨基酸)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.25%.研究可為實(shí)現(xiàn)海參內(nèi)臟高值化開(kāi)發(fā)利用提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有關(guān)海參肽的生物活性有待進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯： 陳志賢 英文審校： 劉源崗)

Study on Preparation of Sea Cucumber Peptides by Enzymatic Hydrolysis of Sea Cucumber Viscera

YANG Dongda， QIN Hong， HUANG Yayan，YE Jing， ZHANG Xueqin， XIAO Meitian

(College of Chemical Engineering， Huaqiao University， Xiamen 361021， China)

The degree of hydrolysis and molecular weight distribution of peptides were employed as indicators to investigate the enzymatic hydrolysis effects of different proteases and screen out the suitable protease for the hydrolysation of sea cucumber viscera. Single factor and orthogonal experiments were used to optimize the hydrolysis process. The results showed that trypsin had the best hydrolysis efficacy and could be used for the preparation of sea cucumber peptides from sea cucumber viscera. The optimum hydrolysis conditions were as follows: percentage of substrate quality 1.0%， enzyme dosage 0.375 1 mkat·g-1， pH=8.0， temperature 37 ℃， and enzymolysis time 5 h. The degree of hydrolysis was 48.90% under the optimum hydrolysis conditions. The content of polypeptides (2 000-5 000 u) and oligopeptides (containing amino acid)(≤2 000 u) in the hydrolysate were 52.68% and 47.25% respectively.

sea cucumber peptide； sea cucumber viscera； trypsin； enzymatic hydrolysis method； degree of hydrolysis

10.11830/ISSN.1000-5013.201704016

2017-02-22

肖美添(1968-)，男，教授，博士，主要從事海洋功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的研究.E-mail:mtxiao@hqu.edu.cn.

福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目(2013019)； 福建省泉州市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2014Z100)

Q 814

A

1000-5013(2017)04-0531-06