ISO 15189 在核酸檢測性能驗(yàn)證方法中的應(yīng)用價(jià)值

林松峰

ISO 15189 在核酸檢測性能驗(yàn)證方法中的應(yīng)用價(jià)值

林松峰

目的探討經(jīng)血傳播疾病的核酸檢測采用磁珠法-實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，針對這些方法進(jìn)行性能驗(yàn)證，以符合國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）15189的申報(bào)要求。方法針對血液篩查檢測的核酸檢測系統(tǒng)，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、靈敏度、特異性、符合率、符合性、檢出限、抗干擾試驗(yàn)及穩(wěn)定性等8個(gè)方面進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果8個(gè)方面的性能驗(yàn)證數(shù)據(jù)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，所有性能驗(yàn)證結(jié)果都符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的要求。結(jié)論針對核酸檢測采用的性能驗(yàn)證方法能夠滿足ISO 15189的要求，還能提高實(shí)驗(yàn)室對檢測系統(tǒng)性能指標(biāo)的認(rèn)識(shí)，對實(shí)驗(yàn)室技術(shù)管理水平的提高起到重要作用。

ISO 15189；性能驗(yàn)證；核酸檢測；血液篩查檢測

輸血傳播感染性疾病的預(yù)防和控制是全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，而在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）基礎(chǔ)上增加核酸檢測已成為血站實(shí)驗(yàn)室的共識(shí)，其可縮短病原體檢出的窗口期，檢出獻(xiàn)血者中存在的隱匿性感染[1]，降低經(jīng)輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步保障血液安全[2]。但是，核酸檢測試劑的檢測性能能否滿足實(shí)驗(yàn)室的預(yù)期，檢測系統(tǒng)的有效運(yùn)轉(zhuǎn)能否達(dá)到實(shí)驗(yàn)室的要求[3]，成為檢測者需要考慮的問題。IOS 15189要求實(shí)驗(yàn)室必須對檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，本研究就本實(shí)驗(yàn)室在IOS 15189擬申請的過程中，對核酸檢測方法的性能驗(yàn)證進(jìn)行分析和探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本選擇①重復(fù)性：試劑的陰、陽性對照；②精密度：商品化標(biāo)準(zhǔn)品；③靈敏度及特異性：商品化血清評價(jià)盤；④符合性：室間質(zhì)評標(biāo)本；⑤最低檢出限：商品化檢出限標(biāo)準(zhǔn)品和陰性血清；⑥干擾試驗(yàn)：脂肪血：添加相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的脂肪血漿和正常血漿進(jìn)行平行檢測，溶血：添加相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的溶血標(biāo)本和正常標(biāo)本進(jìn)行平行檢測；⑦穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：選擇丙型肝炎病毒（HCV RNA）項(xiàng)中等陽性，即循環(huán)閾值（CT值）在30～35之間的樣本，根據(jù)離心時(shí)間和保存時(shí)間的長短進(jìn)行分組平行檢測。

1.2 試劑及輔料乙型肝炎病毒（HBV DNA）、HCV RNA、人類免疫缺陷病毒（HIV1RNA）（1+2型）、核酸檢測試劑及質(zhì)控試劑（羅氏診斷）。①核酸系列血清評價(jià)盤（康側(cè)斯坦）；②精密性試驗(yàn)：HBV DNA核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50 IU/ml、HCV RNA核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 200 IU/ml、HIV1RNA核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1000 IU/ml（康側(cè)斯坦）；③檢出限試驗(yàn)：HCV RNA核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[世界衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)品]；HBV DNA核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；HIV1RNA核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（康側(cè)斯坦）；④真空采血管（科華）。

1.3 儀器CobasS201核酸檢測系統(tǒng)（羅氏診斷）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法①重復(fù)性：在不少于 10 d的情況下進(jìn)行20次檢測。②精密度：一批次內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)品20次，計(jì)算批內(nèi)精密度；連續(xù)20 d的檢測數(shù)據(jù)，計(jì)算批間精密度。③靈敏度及特異性：一批次完成對血清盤的檢測。④符合性：對參加的衛(wèi)計(jì)委臨檢中心室間質(zhì)評結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。⑤最低檢出限：檢出限標(biāo)準(zhǔn)品在同一批次檢測27孔。⑥干擾試驗(yàn)：脂肪血：使用陰性脂肪血漿，添加標(biāo)準(zhǔn)品（HBV DNA 6.9 IU/ml、HCV RNA 50 IU/ml、HIV1RNA 150 IU/ml）。溶血：使用陰性血漿倍比稀釋溶血標(biāo)本，添加標(biāo)準(zhǔn)品（HBV DNA 6.9 IU/ml、HCV RNA 50 IU/ml、HIV1RNA 150 IU/ml）。⑦穩(wěn)定性試驗(yàn)：將HCV RNA項(xiàng)中等陽性（CT值在30～35之間）樣本，室溫分別放置0、4、8、24和48 h離心。將離心后的陽性樣本2～8 ℃放置0、1、2、3、4 d后進(jìn)行檢測。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)①重復(fù)性：20次檢測結(jié)果不能出現(xiàn)＞1次不符合說明書要求的情況。②精密度：批內(nèi)精密度應(yīng)≤2％，批間精密度應(yīng)≤3％。③靈敏度、特異性和符合率判定標(biāo)準(zhǔn)：均為100％。④符合性判定標(biāo)準(zhǔn)：衛(wèi)計(jì)委室間質(zhì)評的結(jié)果符合性≥80％。⑤最低檢出限判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)滿足26孔為陽性（95％置信區(qū)間），且滿足廠家最低檢出限（HBV DNA 2.3 IU/ml、HCV RNA 6.8 IU/ml、HIV1RNA 50 IU/ml）要求。

1.6 干擾試驗(yàn)①脂肪血標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)滿足：脂肪血檢測值與對照組檢測值偏倚小于+7.5％；三酰甘油含量≤3300 mg/dL時(shí)，均不會(huì)干擾試劑的靈敏度和特異性。②溶血標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)滿足：溶血檢測值與對照組檢測值偏倚小于+7.5％；血紅蛋白含量≤500 mg/dL時(shí)，均不會(huì)干擾試劑的靈敏度和特異性。③穩(wěn)定性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：檢測值與對照組檢測值偏倚小于+7.5％。

2 結(jié)果

2.1 重復(fù)性陰、陽性對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果20次，其檢測結(jié)果為100％，均符合標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 重復(fù)性檢測結(jié)果

2.2 精密度檢測20次，均符合標(biāo)準(zhǔn)。見表2。

表2 精密度檢測結(jié)果

2.3 靈敏度、特異性和符合率采用血型盤，其包含36份標(biāo)本，通過計(jì)算，靈敏度、特異性、符合率均為100％。見表3。

表3 靈敏度、特異性和符合率檢測結(jié)果

2.4 符合性實(shí)驗(yàn)室參加衛(wèi)計(jì)委臨檢中心 2015年度第一次室間質(zhì)評，合計(jì)10份標(biāo)本，其中HIV1RNA反應(yīng)性2例，HBV DNA反應(yīng)性3例，HCV RNA反應(yīng)性3例，符合性為100％。

2.5 最低檢出限該檢測系統(tǒng)在本實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限，其中HBV、HIV1均滿足生產(chǎn)商的要求（95％置信度）；HCV經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析其95％最低檢出限為16.03 IU/ml，不符合說明書要求。見表4。

表4 最低檢出限檢測結(jié)果

2.6 干擾試驗(yàn)

2.6.1 脂肪血檢測結(jié)果 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，380 mg/dL的三酰甘油對各項(xiàng)檢測均無明顯影響，且偏倚均未超過+7.5％。見表5。

表5 脂肪血檢測結(jié)果

2.6.2 溶血檢測結(jié)果 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，血紅蛋白濃度為2800 mg/dL的溶血標(biāo)本對各項(xiàng)檢測無影響，且偏倚均未超過+7.5％。見表6。

表6 溶血檢測結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性

2.7.1 室溫放置后的穩(wěn)定性評價(jià) 每份樣品檢測3次，取均值與對照組（0 h）相比，檢測值（CT）偏倚均小于+7.5％，符合預(yù)期。見表7。

表7 室溫放置后的檢測結(jié)果

2.7.2 離心后冷藏放置的穩(wěn)定性評價(jià) 每份樣品檢測3次，取均值與對照組（0 d）相比，CT值偏倚均小于+7.5％，符合預(yù)期。見表8。

表8 離心冷藏放置后的檢測結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)室的方法學(xué)驗(yàn)證是申請 ISO 15189時(shí)必須提供的數(shù)據(jù)材料，能如實(shí)反映實(shí)驗(yàn)室的檢測水平，其中的重要因素即為試劑與其配套設(shè)備組成的檢測系統(tǒng)，根據(jù)要求只有符合實(shí)驗(yàn)室預(yù)期的檢測系統(tǒng)才能應(yīng)用于檢測，并且對驗(yàn)證的性能指標(biāo)和驗(yàn)證方法的選擇有著比較明確的說明[4]，而血站實(shí)驗(yàn)室根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[5]的要求也需要對檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，方法確認(rèn)應(yīng)盡可能全面，并通過客觀證據(jù)（以性能特征形式）證實(shí)滿足試驗(yàn)預(yù)期用途的要求[6]。

另外，樣本的選擇也十分重要，要能反映驗(yàn)證指標(biāo)的特性，要有溯源性，從而全面地保證驗(yàn)證的客觀性。而在實(shí)際的驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，在HCV RNA的最低檢出限試驗(yàn)中，無論康側(cè)斯坦還是WHO的標(biāo)準(zhǔn)品均不能在本實(shí)驗(yàn)室復(fù)現(xiàn)說明書標(biāo)注的檢測下限，經(jīng)與生產(chǎn)商溝通，其向?qū)嶒?yàn)室提供證明材料說明該試劑最低檢出限符合要求。其次，脂肪血和溶血標(biāo)本對于核酸檢測的影響是非常重要的[7]，但是通過本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，一定濃度的脂肪血和溶血對試驗(yàn)的干擾在一定程度上是可以接受的。在實(shí)際工作中，標(biāo)本的采集、處理、保存不當(dāng)，均會(huì)造成核酸酶污染的假陽性或病毒核酸降解的假陰性，從而影響檢測結(jié)果的真實(shí)性[8]，故標(biāo)本的前處理關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確與穩(wěn)定。為此設(shè)計(jì)了穩(wěn)定性試驗(yàn)以模擬超限情況對中強(qiáng)度陽性標(biāo)本的影響，數(shù)據(jù)表明偏倚是符合預(yù)期的，但并不能說明超限的外部條件對低濃度陽性標(biāo)本的影響可以忽略不計(jì)，尤其是HCV RNA的穩(wěn)定性較差，短時(shí)常溫保存都會(huì)造成病毒核酸的降解[9]，故核酸標(biāo)本應(yīng)該始終處于合理的保存溫度，并在規(guī)定時(shí)限內(nèi)完成檢測。通過對各項(xiàng)指標(biāo)的驗(yàn)證，確認(rèn)系統(tǒng)的分析靈敏度已經(jīng)達(dá)到了生產(chǎn)商的檢測要求，實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)具備了系統(tǒng)所要求的檢測能力[10]。同時(shí)，對于試劑、物料的選擇也有一定的參考作用，以提高實(shí)驗(yàn)室的整體檢測水平，進(jìn)一步保證臨床輸血的安全。

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10.12010/j.issn.1673-5846.2017.02.047

遼寧省血液中心，遼寧沈陽 110044

林松峰（1977.4-），本科學(xué)歷，醫(yī)務(wù)工作人員，主管檢驗(yàn)師。研究方向：檢驗(yàn)方面。E-mail：lxn060109@163.com