BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化羅布麻總黃酮的提取工藝

王慧竹，陳盟杰，石琳，朱文靜，楊鑫

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春130021）

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化羅布麻總黃酮的提取工藝

王慧竹1，2，陳盟杰1，石琳1，朱文靜1，楊鑫1

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春130021）

為研究酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮的提取工藝，以總黃酮提取率為評價指標(biāo)，考察酶用量、酶解pH值、酶解溫度、超聲時間對羅布麻總黃酮提取率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮提取工藝，以響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入值，對主要影響因素進行仿真優(yōu)化。結(jié)果顯示，羅布麻總黃酮的最佳提取工藝條件為：酶用量0.11 g/g、酶解pH5.1、酶解溫度67℃、超聲時間33 min。在此工藝條件下，羅布麻總黃酮提取率為32.26%。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；響應(yīng)面法；羅布麻；總黃酮

羅布麻（Apocynum venetumL.）屬于夾竹桃科多年生宿根性草本植物，又名紅麻、茶葉花、紅柳子，在我國遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、甘肅、山東等地均有分布?！吨袊幍洹酚涊d其“性甘、苦、涼，歸肝經(jīng)，具有平肝安神，清熱利水的功效。主要用于肝陽眩暈、心悸失眠、浮腫尿少”[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物是羅布麻最主要的活性成分[2]，具有調(diào)節(jié)血壓、降血脂、保肝、抗抑郁、抗氧化、鎮(zhèn)靜等功效[3-7]，目前從羅布麻中提取黃酮類化合物的方法主要有煎煮法[8]、熱回流提取法[9]、索式提取法[10]、微波輔助提取法[11]、超聲提取法[12]、閃式提取法[13]等。在提取工藝的研究過程中必定要涉及到優(yōu)化問題，目前較常用的有正交設(shè)計、因子設(shè)計、均勻設(shè)計、中心復(fù)合設(shè)計等。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是近年來研究和應(yīng)用都十分活躍的一種信息處理工具，主要是在對人腦組織結(jié)構(gòu)和運行機制的認(rèn)識理解基礎(chǔ)上，模擬其結(jié)構(gòu)和智能行為的一種工程系統(tǒng)。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation neural network）是人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中基于誤差反向傳播算法的多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，利用BP網(wǎng)絡(luò)能從試驗數(shù)據(jù)中自動獲取數(shù)學(xué)模型，它無須事先給出公式的形式，而是以試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，經(jīng)過訓(xùn)練后獲得一個反映試驗數(shù)據(jù)內(nèi)在規(guī)律的數(shù)學(xué)模型，訓(xùn)練好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能直接進行推理，此外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在處理規(guī)律不明顯、變量多的問題時具有優(yōu)越性[18]。

本研究采用響應(yīng)面試驗與BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，優(yōu)化酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮的工藝條件。以期為進一步開發(fā)羅布麻總黃酮資源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻：吉林市吉林大藥房；蘆丁對照品（純度＞98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；纖維素酶（酶活力＞40 000 U/g）：寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1950雙光束紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵：河南鞏義市英峪儀器廠；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SK2510HP超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；FA2204B電子天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；RT-08多功能粉碎機：榮聰精密科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 蘆丁對照品溶液的制備

精密稱取10.0mg蘆丁對照品，以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液溶解并定容至50mL，搖勻，獲得質(zhì)量濃度為0.20mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

稱取羅布麻葉3.0g，按料液比1∶10（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液30 mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為5.5，加入0.1 g/g纖維素酶，60℃水浴酶解120 min，然后設(shè)超聲功率200 W，超聲提取2次，每次40 min，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，定容至50 mL，即得供試品溶液。

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL的蘆丁對照品溶液，置于10mL的容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min后，再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，并用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min。以空白試劑為對照，于波長504 nm處測定吸光度值A(chǔ)。以質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=13.03C+0.053 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

1.3.4 總黃酮的提取率的測定

精確吸取1.3.2中供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液定容。按1.3.3方法測定其吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算供試品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，羅布麻中總黃酮提取率計算公式如下：

式中：W為總黃酮提取率，%；C為根據(jù)吸光度值計算出的溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；D為溶液稀釋倍數(shù)；V為供試品溶液體積，mL；m為藥材取樣量，g。

1.3.5 單因素試驗

以酶用量（按每克藥材用量計）、酶解pH、酶解溫度、超聲時間為主要影響因素進行單因素試驗，考察酶用量（0.06 g/g、0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g、0.15 g/g）、酶解pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、超聲時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）對羅布麻總黃酮提取率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗

通過單因素試驗，選取酶用量（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）、超聲時間（D）為影響因素，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以羅布麻總黃酮提取率（Y）為評價指標(biāo)，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析[14]，以-1、0、1編碼分別代表自變量低、中、高水平，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 羅布麻總黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for total flavonoids extraction process optimization ofA.venetum

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗結(jié)果和響應(yīng)面試驗結(jié)果采用SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計分析，圖表采用Origin 8.5軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對總黃酮提取率的影響

圖1 酶用量對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由圖1可知，總黃酮的提取率隨著酶用量的增大而增加。當(dāng)酶用量從0.06 g/g增至0.10 g/g時，總黃酮提取迅速增加；繼續(xù)增加酶用量?？傸S酮提取率增加變化不明顯。因此，選擇酶用量為0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g進行響應(yīng)面試驗。

2.1.2 酶解pH對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，羅布麻總黃酮提取率隨pH的升高而增加，當(dāng)酶解pH 5.0時總黃酮提取率達(dá)到最大，為31.5%；當(dāng)酶解pH＞5.0時，總黃酮提取率隨pH的升高而下降。因此，選擇酶解pH為5.0、5.5、6.0進行響應(yīng)面試驗。

圖2 酶解pH對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

2.1.3 酶解溫度對總黃酮提取率的影響

圖3 酶解溫度對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由圖3可知，隨酶解溫度的增加，總黃酮提取率呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)酶解溫度從40℃升高至60℃時，總黃酮提取率逐漸增加，并到達(dá)最大值，為31.1%；繼續(xù)增加酶解溫度，羅布麻總黃酮提取率開始下降，因此，選擇酶解溫度為50℃、60℃、70℃進行響應(yīng)面試驗。

2.1.4 超聲時間對總黃酮提取率的影響

圖4 超聲時間對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由圖4可知，羅布麻總黃酮提取率隨超聲時間的延長而增加，當(dāng)超聲時間在20～30 min范圍內(nèi)時，總黃酮提取率隨著時間的延長不斷增大，超聲時間＞30 min后，提取率基本上保持不變。因此，選擇超聲時間為30min、40min、50min進行響應(yīng)面試驗。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取酶用量（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）、超聲時間（D）為自變量，以羅布麻總黃酮提取率（Y）為評價指標(biāo)，進行響應(yīng)面試驗，其試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 羅布麻葉總黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for total flavonoids extraction process optimization ofA.venetum

利用SAS 9.4軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到以總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值的羅布麻葉總黃酮提取工藝參數(shù)多元二次回歸方程：

Y=-291.758+1310.375A+69.075B+1.159C+1.3393D-5129.167A2-61AB+4.2875AC-4.475AD-4.981667B2-0.1295BC+0.0025BD-0.005 904C2-0.002CD-0.009 867D2

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.216 4＞0.05），說明回歸方程擬合度良好，失擬因素對方程干擾較小。方程的決定系數(shù)R為0.932 5，說明響應(yīng)值的變化有93.25%來源于所選變量，一次項A、C對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），說明酶用量、酶解溫度對羅布麻總黃酮提取率均具有極顯著影響；而交互項AC、AD對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；交互項AB顯著水平（P＜0.05）；二次方項A2、B2和D2對結(jié)果影響極其顯著（P＜0.01），而二次方項C2對結(jié)果影響影響呈顯著水平（P＜0.05）。表明試驗得到的回歸方程有效性和實用性良好，可用于分析酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮工藝結(jié)果。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

為了更加直觀地表達(dá)各因素交互作用對羅布麻總黃酮提取率的影響，可以固定其中兩個因素的值為零水平對應(yīng)的值，考慮另兩個因素對總黃酮提取率的影響，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，曲面越陡峭，表明該因素對總黃酮提取率的影響越顯著，響應(yīng)值也越大；從等高線可以看出總黃酮提取率的最佳條件應(yīng)該在圓心處[15-17]。酶用量與酶解溫度的交互作用、酶用量與超聲時間的交互作用、酶用量與酶解pH的交互作用對羅布麻總黃酮的提取率影響比較顯著，而這與表3的分析結(jié)果正相吻合。

利用SAS9.4軟件RSREG語句對模型進行典型性分析，得到羅布麻總黃酮提取的最佳工藝為：酶用量0.112g/g，酶解pH值5.28，酶解溫度64.95℃，超聲時間35.50 min，在此工藝條件下，羅布麻葉總黃酮提取率的理論預(yù)測值為31.34%，考慮到實際操作情況，將最佳工藝條件修正為酶用量為0.11 g/g，酶解pH值5.3，酶解溫度65℃，超聲時間36 min，在此工藝條件下，經(jīng)過5次重復(fù)性驗證試驗，獲得羅布麻總黃酮提取率為31.10%。

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)試驗結(jié)果分析

在酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮提取率的響應(yīng)面分析基礎(chǔ)上，進行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練及仿真，采用27組試驗數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練，其中輸入層為4，分別是酶用量、酶解pH、酶解溫度及超聲時間。隱藏層的數(shù)目訓(xùn)練次數(shù)等對結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），經(jīng)過多次建模，最終確定隱藏層數(shù)目為35層。建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練次數(shù)為10 000，精度為0.01，訓(xùn)練函數(shù)為‘trainscg’。當(dāng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練至2099步時達(dá)到訓(xùn)練精度的要求（即0.01），將網(wǎng)絡(luò)仿真值與響應(yīng)面試驗結(jié)果實測值進行比較[19]，結(jié)果見表4。

圖5 酶用量、酶解pH、酶解溫度和超聲時間交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effect of interaction between enzyme addition,enzymolysis pH,enzymolysis temperature and ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

表4 網(wǎng)絡(luò)仿真值與實測值的模擬誤差Table 4 Simulation error of network simulation value and practical measured value

由表4可知，運用訓(xùn)練后的網(wǎng)絡(luò)對主要因素進行仿真與優(yōu)化，得出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的最佳提取工藝為：酶用量0.114 g/g、酶解pH5.15、酶解溫度67℃、超聲時間33 min，在此條件下，總黃酮提取率預(yù)測值為32.12%。結(jié)合實際操作情況，將最佳工藝條件修正為酶用量0.11 g/g、酶解pH5.1、酶解溫度67℃、超聲時間33 min，在此條件下，總黃酮提取率實測值為32.26%。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測值與實測值的相對誤差（0.44%）較響應(yīng)面優(yōu)化的相對誤差（0.77%）小，且BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的工藝條件所提取的黃酮提取率更高，說明該BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以更好地預(yù)測不同工藝參數(shù)下羅布麻葉中總黃酮的提取率。

3 結(jié)論

本研究采用酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮，在單因素試驗基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝，再以響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)經(jīng)過建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，并對所建的模型進行訓(xùn)練和仿真預(yù)測檢驗樣本。結(jié)果表明，羅布麻總黃酮提取的最佳工藝條件為：酶用量0.11g/g、酶解pH5.1、酶解溫度67℃、超聲時間為33min。在此工藝條件下，羅布麻總黃酮提取率預(yù)測值為32.12%，實測值為32.26%，網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和實測值的相對誤差為0.44%＜1.0%，表明建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測性能良好，可對羅布麻總黃酮提取結(jié)果進行預(yù)測。

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Optimization of extraction process of total flavonoids fromApocynum venetumby BP neural network and response surface methodology

WANG Huizhu1,2,CHEN Mengjie1,SHI Lin1,ZHU Wenjing1,YANG Xin1
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022,China; 2.Pharmaceutical School，Jilin University，Changchun 130021,China）

In order to study the extraction process of total flavonoids fromApocynum venetumby enzymatic assisted ultrasonic extraction,using the total flavonoid extraction rate as evaluation indexes,the effects of enzyme addition,enzymolysis pH,enzymolysis temperature and ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids fromA.venetumwas investigated.On the basis of single factor experiments,extraction process conditions of total flavonoid were optimized by response surface methodology(RSM).With RSM data as input value of BP neural network,the main influence factors were simulated and optimized.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids fromA.venetumwere enzyme 0.11 g/g,enzymolysis pH 5.1,enzymolysis temperature 67℃and ultrasonic time 33 min.Under the conditions,the extraction rate of total flavonoids fromA.ventrumwas 32.26%.

BP neural network;response surface methodology;Apocynum venetum;total flavonoids

R931.6

0254-5071（2017）06-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.031

2017-02-25

吉林化工學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目（吉化院合字[2013]第44號）；吉林市科技創(chuàng)新計劃項目（20161215）

王慧竹（1981-），女，講師，博士研究生，研究方向為體內(nèi)藥物分析。