泥蒿葉總黃酮的酶法提取及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

陳瑤，吳龍?jiān)拢蚋＃?*，曹佩佩，向睿富，方元平，2

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃岡438000）

泥蒿葉總黃酮的酶法提取及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

陳瑤1，吳龍?jiān)?，向福1，2*，曹佩佩1，向睿富1，方元平1，2

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃岡438000）

以大別山黃州地區(qū)泥蒿葉為原料，采用酶法輔助提取總黃酮。基于單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了泥蒿葉總黃酮的酶法提取工藝，并探討了總黃酮提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，總黃酮提取的最佳工藝為纖維素酶用量3%，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶10（g∶mL），提取溫度50℃，提取時(shí)間4 h。在此條件下，總黃酮提取率為4.12%。泥蒿葉總黃酮提取液總抗氧化能力相當(dāng)于相同質(zhì)量濃度VC的50%，羥基自由基清除能力是相同質(zhì)量濃度VC的1.4～2.7倍，表明其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

泥蒿葉；總黃酮；酶法提??；抗氧化活性；羥基自由基清除能力

泥蒿（Artemisia selengensis）是菊科（Asteraceae）蒿屬多年生宿根草本植物，學(xué)名狹葉艾，又名水艾、蘆蒿、蔞蒿、藜蒿、水蒿等[1]，廣泛分布于華北、東北及長(zhǎng)江中下游等地區(qū)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載泥蒿“久服輕身，耳聰目明，不老”；《本草綱目》描述其“補(bǔ)中益氣，利膈開胃，療心懸”、“祛風(fēng)寒濕痹”；民間以其全草入藥，可治創(chuàng)傷、急性肝炎、寒冷腹痛等，且無副作用[2]。因此，泥蒿是一種集食用和藥用于一身的保健蔬菜，在醫(yī)藥保健領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

大別山地區(qū)泥蒿資源豐富，以采食其冬春季節(jié)的嫩莖為主，成熟的老莖、葉則大量廢棄。泥蒿及其葉富含黃酮、谷甾醇及香豆素等生物活性物質(zhì)[2-4]，而黃酮類化合物則被認(rèn)為是泥蒿的主要活性成分[5-6]，具有防衰老、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑菌、降血脂、降血糖、降血壓以及緩解心血管疾病等功效[3，7-9]。探討綠色環(huán)保、經(jīng)濟(jì)可行的泥蒿葉黃酮提取工藝，對(duì)綜合利用泥蒿資源，發(fā)展高附加值的泥蒿產(chǎn)業(yè)具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和現(xiàn)實(shí)意義。

乙醇價(jià)廉易得且毒性小，便于回收使用，故植物總黃酮的提取多采用醇提法[10]。文獻(xiàn)報(bào)道纖維素酶通過酶解細(xì)胞壁不僅能促進(jìn)植物活性成分的溶出，且和乙醇聯(lián)用提取黃酮類物質(zhì)還具有協(xié)同作用[11-12]。本研究以大別山黃州地區(qū)泥蒿葉為研究對(duì)象，采用酶法輔助乙醇提取泥蒿葉中總黃酮，通過單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，并利用總抗氧化活性和羥基自由基清除能力評(píng)價(jià)泥蒿葉總黃酮提取物的抗氧化活性，以期為綜合利用泥蒿資源、生產(chǎn)高附加值的黃酮類物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥蒿葉：采自黃岡市黃州區(qū)春陽(yáng)蔬菜合作社基地，陰干、粉碎備用；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）：上海新寶精細(xì)化工廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：上海金穗生物科技有限公司；酸性纖維素酶（20 000 U/g）CAS 9012-54-8：湖北帝鑫化工制造有限公司；維生素C（vitamin C，VC）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.99%）：上海麥克林生化科技有限公司；總抗氧化試劑盒（批號(hào)20161117）、羥基自由基試劑盒（批號(hào)20161121）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104電子分析天平：上海精細(xì)天平有限公司；Cary-100紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及總黃酮提取率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.66 mg，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液配成母液，分別取母液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL于25 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液5.5 mL，加5%亞硝酸鈉1 mL后搖勻放置6 min，加入10%的硝酸鋁溶液1 mL后搖勻放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至刻度，放置15 min后，以未加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑為空白，在波長(zhǎng)509 nm處檢測(cè)其吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=12.197C+0.003 9，R2=0.999 6，表明蘆丁質(zhì)量濃度在8.6～59.7 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算泥蒿葉樣品中總黃酮的含量及總黃酮提取率，總黃酮提取率計(jì)算公式如下：

式中：E為總黃酮提取率，%；C為提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；N為提取液稀釋倍數(shù)；m為泥蒿葉的質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

稱取5份泥蒿葉粉末5 g置于圓底燒瓶，分別考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%）、纖維素酶量（泥蒿葉質(zhì)量1%、2%、3%、4%、5%）、提取時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）和提取溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）等因素對(duì)泥蒿葉中總黃酮提取率的影響。

1.3.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

表1 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for total flavonoids extraction process optimization

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)泥蒿葉總黃酮提取率影響較顯著的纖維素酶用量（A）、提取時(shí)間（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）等因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

1.3.4 總抗氧化能力評(píng)價(jià)

分別配制0.065 g/L、0.130 g/L、0.220 g/L、0.260 g/L和0.325g/L系列質(zhì)量濃度的泥蒿葉總黃酮提取液，并以相同質(zhì)量濃度的VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)總抗氧化試劑盒說明書操作后，將測(cè)試管、對(duì)照管樣液在波長(zhǎng)520nm處測(cè)定吸光度值。

在37℃時(shí)，每毫升樣品每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度每增加0.01時(shí)，定義為一個(gè)總抗氧化能力單位（U），則總抗氧化能力計(jì)算公式如下：

式中：T為總抗氧能力，U/mL；As為測(cè)定管吸光度值；Ac為對(duì)照管吸光度值；Vt為反應(yīng)液總體積，mL；Vs為取樣量，mL；n為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.5 羥基自由基清除能力評(píng)價(jià)

分別配制0.065 g/L、0.130 g/L、0.220 g/L、0.260 g/L和0.325 g/L系列質(zhì)量濃度的泥蒿葉總黃酮提取液，并以相同質(zhì)量濃度的VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)羥基自由基試劑盒說明書操作后，將測(cè)定管、空白管、對(duì)照管樣液在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)定吸光度值。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：H為羥基自由基清除率，%；OD1為測(cè)定管吸光度值；OD2為對(duì)照管吸光度值；OD3為空白管吸光度值。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用正交設(shè)計(jì)助手II v3.1和EXCEL 2003軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，通過F值分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 纖維素酶量對(duì)總黃酮提取率的影響

考察纖維素酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 纖維素酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，總黃酮提取率隨纖維素酶用量的增加呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)纖維素酶用量為3%時(shí)，總黃酮提取率最高，為3.71%，繼續(xù)添加酶量，則總黃酮提取率下降。盡管纖維素酶用量為4%和5%時(shí)所得總黃酮提取率發(fā)生起伏變化，但二者統(tǒng)計(jì)分析并無顯著差異（P=0.33＞0.05）。這是因?yàn)槊噶吭黾拥揭欢ǔ潭葧r(shí)，酶分子過于飽和，一部分酶不能與底物結(jié)合，使得水解速度變慢[14]，且酶量太多則具有粘附性[15]，阻礙黃酮物質(zhì)的溶出，從而使總黃酮得率下降。因此，選擇纖維素酶用量3%為宜。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

考察提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，隨著提取時(shí)間從1 h增加至3 h，總黃酮提取率達(dá)到峰值，為4.11%，繼續(xù)增加提取時(shí)間，總黃酮提取率下降趨勢(shì)明顯。這可能是由于隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，某些在乙醇溶液中對(duì)熱不穩(wěn)定的黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被分解轉(zhuǎn)化或氧化破壞，從而導(dǎo)致總黃酮提取率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)[16]。因此，選擇泥蒿葉總黃酮提取時(shí)間3 h為宜。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～40%時(shí)，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到峰值，為4.01%，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮提取率則開始下降。這可能是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，親脂性物質(zhì)、色素等成分大量溶出，與黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合乙醇-水分子[17-18]，從而降低了泥蒿葉總黃酮的提取效果。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%為宜。

2.1.4 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

考察提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，隨著提取溫度的增加，泥蒿葉總黃酮提取率不斷上升，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，總黃酮提取率急劇增加至4.01%；60℃時(shí)達(dá)到最高提取率4.27%，然后趨于穩(wěn)定。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)50℃和60℃條件下所得總黃酮提取率無顯著性差異（P=0.14＞0.05），即50℃時(shí)泥蒿葉總黃酮提取率已趨于穩(wěn)定，繼續(xù)升高溫度提取率增幅不明顯。因此，綜合考慮選擇提取溫度50℃為宜。

2.1.5 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

考察料液比對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，料液比對(duì)泥蒿葉總黃酮提取率有顯著影響。料液比從1∶5（g∶mL）增加至1∶10（g∶mL）時(shí)，泥蒿葉總黃酮提取率增加到峰值，為5.32%，差異性顯著（P=0.04＜0.05）；繼續(xù)增加料液比，總黃酮提取率開始下降，且下降趨勢(shì)明顯（P=0.04＜0.05）。因此，選擇料液比1∶10（g∶mL）為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定料液比為1∶10（g∶mL），提取溫度50℃，以總黃酮提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以纖維素酶用量（A）、提取時(shí)間（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為變量因子，設(shè)計(jì)L9（33）正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for total flavonoids extraction process optimization

由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響次序?yàn)椋篊＞B＞A，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞纖維素酶用量，表3方差分析也表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)泥蒿葉總黃酮提取的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其他因素影響不顯著。總黃酮提取最佳工藝條件為A2B3C2，即纖維素酶用量為3%，提取時(shí)間為4 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在總黃酮提取最佳工藝條件下，即料液比1∶10（g∶mL）、提取溫度50℃、纖維素酶用量3%、提取時(shí)間4 h和乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，平行提取3次，總黃酮提取率為（4.12±0.09）%，高于表2中最大總黃酮提取率（3.86%），表明正交設(shè)計(jì)所確定的條件為優(yōu)選。

2.4 總抗氧化能力評(píng)價(jià)

測(cè)定泥蒿葉提取液中總黃酮質(zhì)量濃度為6.50 g/L，分別稀釋100倍、50倍、30倍、25倍、20倍后得到0.065 g/L、0.130 g/L、0.220 g/L、0.260 g/L和0.325 g/L等系列質(zhì)量濃度的泥蒿葉總黃酮樣品，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，各樣品的總抗氧化能力如圖6所示。

圖6 泥蒿葉總黃酮和VC的總抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of total antioxidant activity of total flavonoids fromA.selengensisleaves and VC

由圖6可知，5種質(zhì)量濃度泥蒿葉總黃酮提取液的總抗氧化能力均低于相同質(zhì)量濃度的VC。當(dāng)總黃酮提取液質(zhì)量濃度從0.065 g/L增至0.130 g/L時(shí)，泥蒿葉總黃酮提取液和VC的總抗氧化能力急劇增加，增加至0.220 g/L時(shí)，二者的總抗氧化能力分別達(dá)到13.45 U/mL和27.06 U/mL，繼續(xù)增加溶液的質(zhì)量濃度，二者的總抗氧化能力趨于穩(wěn)定。泥蒿葉總黃酮提取液的總抗氧化能力相當(dāng)于相同質(zhì)量濃度VC的50%，表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，但抗氧化能力不強(qiáng)，這可能是由于泥蒿葉中總抗氧化能力主要是由酚酸類物質(zhì)決定，而黃酮類物質(zhì)只是其中一種抗氧化成分[19-22]。

2.5 羥基自由基清除能力評(píng)價(jià)

泥蒿葉總黃酮和VC樣品的羥基自由基清除能力如圖7所示。

由圖7可知，泥蒿葉總黃酮提取液和VC的羥基自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的升高而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.325 g/L時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最高，分別達(dá)到93.80%和64.14%；總黃酮提取液從0.130 g/L濃度開始，盡管差異性顯著（P＜0.05），但增幅較小；而VC的羥基自由基清除能力則上升趨勢(shì)明顯（P＜0.001）。五種質(zhì)量濃度的泥蒿葉總黃酮提取液的羥基自由基清除能力均明顯高于相同質(zhì)量濃度的VC，且羥基自由基清除率是相同質(zhì)量濃度VC的1.4～2.7倍。因此，泥蒿葉總黃酮提取液具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

圖7 泥蒿葉總黃酮和VC的羥基自由基清除能力的比較Fig.7 Comparison of hydroxyl radical scavenging activity of total flavonoids fromA.selengensisleaves and VC

3 結(jié)論

本研究以大別山黃州地區(qū)泥蒿葉為材料，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)酶法提取泥蒿葉總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，總黃酮提取的最佳工藝條件為纖維素酶用量3%，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶10（g∶mL），提取溫度50℃，提取時(shí)間4 h，在此條件下，總黃酮提取率可達(dá)4.12%。同時(shí)泥蒿葉總黃酮提取液總抗氧化能力相當(dāng)于相同質(zhì)量濃度VC的50%，而羥基自由基清除能力較強(qiáng)，是相同質(zhì)量濃度VC的1.4～2.7倍，對(duì)科學(xué)利用泥蒿資源，發(fā)展高附加值的泥蒿產(chǎn)業(yè)具有參考價(jià)值和應(yīng)用前景。

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Optimization of enzyme extraction conditions of total flavonoids fromArtemisia selengensisleaves and its antioxidant activity

CHEN Yao1,WU Longyue1,XIANG Fu1,2*,CAO Peipei1,XIANG Ruifu1,FANG Yuanping1,2
(1.College of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huanggang 438000,China; 2.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains,Huanggang 438000,China)

Using theArtemisia selengensisleaves in the Dabie Mountain area as raw material,the total flavonoids was extracted by enzyme-assisted extraction.Based on the single factor and orthogonal experiments,the enzyme extraction process conditions of total flavonoids fromA.selengensis leaves were optimized,and the antioxidant activities of total flavonoid extracts were discussed.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids were cellulase addition 3%,ethanol concentration 40%,solid-liquid ratio 1∶10(g∶ml),extraction temperature 50℃and time 4 h.Under the conditions,the extraction rate of total flavonoids was 4.12%.In addition,with the same mass concentrations,the total antioxidant activity of total flavonoids extracts fromA.selengensisleaves was 50%of that of VC,the hydroxyl free radical scavenging ability was 1.4-2.7 times of that of VC,which revealed that the total flavonoids fromA.selengensleaves had strong antioxidant activity.

Artemisia selengensisleaves;total flavonoids;enzyme extraction;antioxidant activity;hydroxyl free radical scavenging ability

R284.2

0254-5071（2017）06-0142-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.029

2017-02-20

大學(xué)生創(chuàng)新培育項(xiàng)目（sgpx201602）

陳瑤（1995-），女，本科生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取。

*通訊作者：向福（1977-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊恢参镔Y源利用。