不同株系赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性研究

張俊杰，楊旭，焦健，陳錦永，何培新，遲雷，張文葉，劉崇懷*

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002；3.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

不同株系赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性研究

張俊杰1，2，3，楊旭1，焦健3，陳錦永3，何培新1，遲雷1，張文葉1，劉崇懷3*

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002；3.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

通過采用富集分離方法，從3個赤霞珠株系（R5、ISV-FV5和169）的葡萄果實表皮共分離得到酵母菌36株。利用26S rDNA的D1/D2和5.8S-ITS區(qū)序列分析并結(jié)合形態(tài)學特征對這些菌株進行了多樣性研究。共鑒定出3個酵母菌屬的4個已知種群，分別為Cryptococcus magnus、Cryptococcus uzbekistanensis、Rhodosporidiobolus ruineniae和Hanseniaspora uvarum。Hanseniaspora uvarum為株系R5所特有，Cryptococcus uzbekistanensis和Rhodosporidiobolus ruineniae為株系ISV-FV5所特有，而Cryptococcus magnus同時存在于株系ISV-FV5和169上。結(jié)果表明，不同株系的赤霞珠葡萄表皮蘊含著多種類型的酵母菌資源，而且盡管其生長的客觀條件是一致的，但因為株系的不同其所含酵母菌種群的組成上也存在明顯的差異。

赤霞珠；酵母菌；26S rDNA D1/D2；5.8S-ITS；多樣性

由于葡萄酒獨具的營養(yǎng)滋補作用、醫(yī)學作用（如延緩衰老、預(yù)防心腦血管疾?。?、預(yù)防癌癥、美容養(yǎng)顏作用及文化熏陶的作用，使得近年來葡萄酒在我國國內(nèi)需求不斷增長，我國成為了世界上葡萄酒消費增長最快的市場。到2015年，我國葡萄栽培面積已經(jīng)達到77.9 khm2，葡萄產(chǎn)量達到1 367萬t，葡萄酒年產(chǎn)量114萬kL，已經(jīng)成為世界矚目的葡萄生產(chǎn)第一大國。中國葡萄酒產(chǎn)區(qū)主要集中于北緯38～53°之間的黃金帶上，由東向西，梯次布局，如渤海灣產(chǎn)區(qū)、沙城產(chǎn)區(qū)、清徐產(chǎn)區(qū)、黃河故道產(chǎn)區(qū)等。從葡萄的品種看，赤霞珠、蛇龍珠、美樂和霞多麗是中國各大產(chǎn)區(qū)比較普遍種植的葡萄品種[1-2]。

影響葡萄酒風味的原因主要有3個，即釀酒原料（釀酒葡萄）、釀造工藝以及發(fā)酵過程中微生物的代謝，其中以微生物的代謝影響最為重要，菌種的差異決定了風味物質(zhì)的含量與種類[3]。葡萄酒的發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的微生物參與的生物化學變化過程，酵母菌是發(fā)酵過程的主導(dǎo)微生物[4]。在葡萄酒生產(chǎn)中，酵母作為主要的發(fā)酵微生物不僅對葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量和發(fā)酵生產(chǎn)管理影響很大，而且對葡萄酒特色和風格的形成有重要貢獻[5]。葡萄酒發(fā)酵過程中的大多數(shù)酵母來自果皮，僅有少數(shù)來自空氣。葡萄表面的野生酵母是最豐富的。成熟葡萄裂果流汁，促使酵母繁殖，因此成熟葡萄果粒表面附生大量酵母菌。果皮蠟質(zhì)有助于這些酵母菌的附著，因此葡萄果粒破碎后不久酵母就會大量繁殖，出現(xiàn)自然發(fā)酵現(xiàn)象[6]。葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)（如揮發(fā)酸、酯類、高級醇等）的組成與含量比例都與酵母菌有密切關(guān)系[7-8]。

在傳統(tǒng)葡萄和葡萄酒產(chǎn)區(qū)，酵母菌適應(yīng)了當?shù)氐臍夂?、土壤、葡萄品種，以及自然選擇的作用，逐漸形成了適應(yīng)當?shù)仄咸丫频木?。所以，傳統(tǒng)葡萄釀酒園區(qū)釀出的美酒，與商業(yè)化相比，具有很強的產(chǎn)區(qū)風格和地方特性[5]。目前我國在葡萄酒酵母的研究和利用方面發(fā)展還遠不如生產(chǎn)方面的發(fā)展迅速，葡萄酒生產(chǎn)所用菌種大部分依賴進口，造成在品種和風格上比較單一，地域特色不突出[9-10]。目前，大部分的研究都是對于一種葡萄的酵母資源所做的研究，對不同株系的同一品種的葡萄酵母資源研究鮮有報道。

國外對酵母資源的研究，早期以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主。近年來，葡萄釀酒酵母菌的研究不再局限于釀酒酵母，非釀酒酵母的釀酒特性研究、生物多樣性研究及分類鑒定逐漸成為國外近年來的研究熱點[11]。我國對釀酒葡萄相關(guān)酵母菌多樣性的研究報道較少。楊美景[11]從昌黎葡萄產(chǎn)區(qū)141個菌源樣品中分離到2 101株酵母菌；李新菊[12]從新疆石河子葡萄園的優(yōu)質(zhì)葡萄“霞多麗”自然發(fā)酵汁中分離出5株酵母菌；張春芝等[13]從寧夏產(chǎn)區(qū)的葡萄園土壤、葡萄果實表皮已經(jīng)葡萄酒發(fā)酵過程中獲得729株野生酵母菌，最終確定為16個酵母類型；凌云[14]從昌黎產(chǎn)區(qū)以赤霞珠葡萄果粒為材料，分離出33株酵母菌，最終獲得優(yōu)異菌株CLY03和CLY04。

河南省境內(nèi)目前在葡萄屬（Vitis viniferaL.）植物發(fā)現(xiàn)了14個種、1個亞種及1個變種[15]。本研究以中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹所葡萄資源圃中不同株系的釀酒葡萄“赤霞珠”成熟果實新鮮表皮為原料，對酵母菌進行富集分離和多樣性研究（WL表型鑒別和26S rDNA D1/D2區(qū)段及5.8S-ITS區(qū)測序和系統(tǒng)發(fā)育分析[16]），初步比較了不同株系赤霞珠葡萄表皮所蘊含酵母菌種群的組成差異。本研究對赤霞珠葡萄不同株系果皮酵母菌組成的認識，對葡萄酒制作過程中對釀酒葡萄的選擇具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

葡萄原料采自鄭州果樹研究所葡萄種質(zhì)資源圃，選擇赤霞珠葡萄共3個不同的株系（R5、ISV-FV5和169，分別用1、2和3表示）的成熟果實各三串（由于葡萄種質(zhì)資源圃一株葡萄的數(shù)量很少，所以每株只選取了3串）。采集當天運回實驗室，于無菌條件下從每個株系的三串葡萄平均取葡萄表皮并混合作為該株系的菌種富集出發(fā)材料，直接搖瓶發(fā)酵。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠。

1.1.3 主要試劑

Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（酵母）、26SrDNA引物：NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）、NL-4（5'-GGT CCG TGT TTCAAG ACG G-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化安泰公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：中興科技有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療器械有限公司；TCL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；C1000聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國伯樂公司；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)：上海精密科學儀器有限公司；FD-4new真空干燥機：鄭州沃邦儀器設(shè)備有限公司；DH-600型電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；BL3-DYY-6C電泳儀：西化儀（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄皮酵母菌富集、分離及純化

在滅過菌的50 mL YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中無菌條件下加入10顆葡萄漿果表皮，同時加入200 μL氯霉素（10 mg/mL）溶液（抑制細菌生長），每個株系做3組。在搖床中180 r/min，28℃條件下培養(yǎng)48 h。

用1 000 μL移液器吸取酵母富集液1 mL，加入9 mL無菌水試管中，旋渦振蕩混勻，制成10-1酵母菌懸液，標上記號。按照上述方法依次稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8酵母菌稀釋液。

用200 μL移液器取200 μL上述梯度稀釋的酵母菌懸液滴加在YEPD固體培養(yǎng)基平板（加入氯霉素）上，用涂布棒涂布均勻，每個梯度平行涂布兩個平板。涂布好的平板放置在恒溫培養(yǎng)箱中28℃條件下培養(yǎng)3 d。結(jié)合挑取YEPD培養(yǎng)基上不同形態(tài)的選取10～20個菌落保藏，在新的YEPD平板上3次劃線純化，并倒置培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱中28℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.2 WL培養(yǎng)基表型鑒定及代表菌株的顯微形態(tài)觀察

挑取YEPD平板上的酵母菌單菌落，在WL培養(yǎng)基上3次劃線并倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃條件下培養(yǎng)5 d。然后，根據(jù)菌落表型的差異，對供試菌進行初步分類并挑選代表菌株進行顯微形態(tài)的觀察。顯微形態(tài)觀察在光學顯微鏡下進行，采集代表菌株的顯微形態(tài)照片，并做好記錄。

1.3.3 菌株的保存及菌體的收集

挑取酵母菌單菌落接種于含有3 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，在恒溫搖床上以180r/min的轉(zhuǎn)速，28℃的培養(yǎng)溫度，振蕩培養(yǎng)24 h。超凈工作臺內(nèi)取1 mL菌液與1 mL無菌的50%甘油混勻并加入甘油管中，于-80℃冰箱冷凍保存。另取1.5 mL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，收集菌體，暫存于-20℃冰箱中。

1.3.4 酵母菌的分子生物學鑒定

（1）代表菌株DNA的提取

按照Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒的說明提取酵母菌基因組DNA，并在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。

（2）26S rDNA Dl/D2區(qū)段的擴增及測序

使用正向引物NL1（5′-GCATATCGGTAAGCGGAG GAAAAG-3′），反向引物NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAG ACGG-3′）進行26SrDNADl/D2區(qū)段的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s，循環(huán)次數(shù)35次，最后，72℃延伸8 min。PCR反應(yīng)液組成（30 μL體系）：每管中PCR緩沖液（10×）3.0 μL；25 mmol/L MgCl21.8 μL；2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside，dNTP）2.4 μL；10 μmol/L引物各0.6 μL；5 U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，模板DNA 1μL；最后添加ddH2O定容至30μL。

（3）5.8S-ITS區(qū)段擴增[17]

使用正向引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和反向引物ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）進行5.8S-ITS區(qū)基因擴增。PCR循環(huán)次序為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，循環(huán)次數(shù)35次，最后，72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)液的組成（50 μL體系）：每管中含PCR緩沖液（10×）5.0μL；25mmol/L MgCl26.0 μL；10 mmol/L dNTP 1.0 μL；10 μmol/L引物各2.5 μL；0.5 U/μLTaqDNA聚合酶4 μL，l0 ng/μL～l μg/μL模板DNA 1.0 μL；最后添加ddH2O定容至50 μL。

（4）PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測：

取2 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 10×上樣緩沖液混合，點樣到1%的瓊脂糖凝膠（已加入Goldview I型核酸染液）點樣孔里，打開電源開關(guān)，電壓調(diào)至100 V，電泳時間約20 min，用紫外分析儀觀察電泳結(jié)果，初步判斷擴增片段的質(zhì)量和大小，擴增合格的PCR產(chǎn)物送往公司測序。

（5）PCR產(chǎn)物測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果采用MegA6軟件進行序列校正，校正后的26S rDNA D1/D2區(qū)序列及5.8S-ITS區(qū)段序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology infor mation，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對（BLAST）。獲得同源酵母菌株的相應(yīng)序列后，用MEGA6軟件的ClustalW功能對所有供試序列進行匹配排列，然后采用Kimura 2-parameter模型構(gòu)建鄰接法（neighbor-joining，N-J）系統(tǒng)發(fā)育樹，該分析進行1 000次的Bootstraps檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的形態(tài)學觀察及初步聚類分析

2.1.1 葡萄表皮酵母菌的分離、純化與保藏

通過YEPD液體培養(yǎng)基的富集及固體培養(yǎng)基平板的分離和純化，一共從供試3個株系的葡萄表皮分離純化和保藏酵母菌菌株36個。

2.1.2 酵母菌的菌落形態(tài)、顯微觀察及初步聚類分析

根據(jù)36株酵母菌菌株在WL培養(yǎng)基上的表型特征，一共得到6種表型，然后，通過對每個表型代表菌株的顯微形態(tài)觀察，共得到3種顯微形態(tài)，結(jié)果見圖1。詳細的菌株菌落形態(tài)及顯微形態(tài)描述見表1。

圖1 各類型代表菌株在WL培養(yǎng)基上的菌落特征(左)和顯微細胞特征(右)Fig.1 Colony characteristics(left)and microscopic cell characteristics(right)of the representative strains from different types on WL medium

表1 酵母菌基于WL培養(yǎng)基的表型聚類結(jié)果Table 1 Clustering analysis of yeast strains on WL medium based on phenotypes

2.2 酵母菌代表菌株26S rDNA D1/D2區(qū)段的PCR鑒定

2.2.1 酵母菌代表菌株26S rDNA D1/D2區(qū)段的PCR擴增分析

分別從以上6類菌株中挑選代表菌株（101、104、111、115-2、119、203、205、207、209、303、308）進行DNA的提取和26S rDNA D1/D2區(qū)段的PCR擴增，擴增產(chǎn)物的凝膠檢測結(jié)果見圖2，目的區(qū)段大小約600 bp。

圖226S rDNA D1/D2區(qū)段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of 26S rDNA D1/D2 region of PCR products

2.2.2 26S rDNAD1/D2區(qū)段PCR擴增產(chǎn)物的測序與分析

得到的PCR產(chǎn)物送測序公司進行序列測定，得到的序列結(jié)果首先在NCBI主頁（www.NCBI.nlm.nih.gov），利用BLAST功能與Genbank數(shù)據(jù)庫里的已知序列進行同源比對。選擇同源性最高的菌株，一般為99%～100%，然后，選用Mega 6軟件進行序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，建立N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 代表菌株26S rDNA D1/D2區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 26S rDNA D1/D2 for the representative strains

由圖3可知，菌株202與Rhodosporidiobolus ruineniae聚為一個分支，序列相似性為100%，所以菌株202可以被鑒定為Rhodosporidiobolus ruineniae。菌株203和205與Cryptococcus uzbekistanensis聚為一個分支，序列相似性為100%，因而菌株203和205可以被鑒定為Cryptococcus uzbekistanensis。代表菌株101、104、111、115-2和119與Hanseniaspora uvarum聚在一起，序列相似性為100%，因而被鑒定為Hanseniasporauvarum。而代表菌株207、209、303和308與3個已知酵母菌種群Cryptococcusmagnus、Filobasidium floriforme和Filobasidiumelegans聚為一個分支，且相似性均為100%，這與劉愛國等[17]的研究結(jié)果一致，C.magnus、F.magnus和F.floriforme具有完全相同的Dl/D2區(qū)域序列，僅依靠26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析不能區(qū)分這幾個種。因此，對于26S rDNA序列分析不能確認的菌株207、209、303和308，進行5.8S-ITS區(qū)擴增，經(jīng)BLAST分析及5.8S-ITS區(qū)序列相似性計算，與菌株207、209、303、308的5.8S-ITS區(qū)序列相似性最大的酵母菌種群為Cryptococcus magnus，且相似性為100%，結(jié)果見表2，這幾個代表菌株最終被歸為Cryptococcusmagnus，也體現(xiàn)了5.8S-ITS區(qū)段在酵母菌種群鑒定中的作用。

表2 供試菌株5.8S-ITS序列與相關(guān)菌株的序列相似性Table 2 5.8S-ITS of the sequenced strain and the identity withrelated yeast strain

3 結(jié)論

本研究選取鄭州果樹研究所的3個不同株系的赤霞珠葡萄，通過富集和分離共得到36個菌株，最終供試菌被鑒定為3個已知酵母菌屬的四個不同的種群Cryptococcus magnus、Cryptococcus uzbekistanensis、Hanseniaspora uvarum和Rhodosporidiobolusruineniae。Hanseniaspora uvarum為株系R5所特有，Cryptococcus uzbekistanensis和Rhodosporidiobolus ruineniae為株系ISV-FV5所特有，而Cryptococcus magnus同時存在于株系ISV-FV5和169上，其中，酵母種群Rhodosporidiobolus ruineniae在過去的研究中鮮有報道。由此可見，株系ISV-FV5表皮酵母菌具有相對豐富的多樣性，而株系R5和169的表皮酵母菌組成較為單一。前期研究中還發(fā)現(xiàn)來自同一采樣點同一采樣時間獲得的四個不同株系梅鹿輒葡萄表皮含有6種酵母菌，其中Filobasidium floriforme是四個品種所共有的酵母菌種群，而Sporidiobolusruineniae和Hanseniaspora vineae僅為一個株系所獨有，而Rhodotorulagraminis則為兩個株系所共有，由于四個株系都來自同一個品種且種植的客觀環(huán)境一致，它們果皮都含有酵母菌種群Filobasidium floriforme，但是由于株系本身的不同，又分別含有不同于其他株系的特殊的酵母菌種群[18]。而本研究中，僅在株系ISV-FV5和169上發(fā)現(xiàn)了共同含有的酵母菌種群Cryptococcus magnus，但是三個株系并沒有共同的酵母菌種群，并且該研究從赤霞珠葡萄表皮分離得到的酵母菌種群與之前研究中從梅鹿輒葡萄表皮分離得到的酵母菌種群組成也完全不同，這也反映了葡萄品種差異所帶來的果皮酵母菌組成的巨大差異。

本研究中還發(fā)現(xiàn)屬于同一個種群的菌株其形態(tài)特征也具有顯著的差異，如類型Ⅰ、類型Ⅱ和類型Ⅲ，雖然形態(tài)特征不一樣，但是經(jīng)過分子生物學方法發(fā)現(xiàn)都屬于Hanseniaspora uvarum。酵母菌種類和表型分析結(jié)果不完全一致，這與前期的研究結(jié)果相一致[19]，所以僅僅依靠傳統(tǒng)的鑒定方法是遠遠不夠的。只有把傳統(tǒng)的鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學鑒定方法相結(jié)合，才可以更加有效而準確的對未知酵母菌菌株進行分類鑒定。

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Biodiversity of yeast strains on grape surface from different Cabernet Sauvignon clones

ZHANG Junjie1,2,3,YANG Xu1,JIAO Jian3,CHEN Jinyong3,HE Peixin1,CHI Lei1,ZHANG Wenye1,LIU Chonghuai3*
(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China; 2.Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety of Henan Province,Zhengzhou 450002,China; 3.Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,China)

With enrichment and isolation methods,36 yeast strains were obtained from grape surface of three different Cabernet Sauvignon(R5, ISV-FV5 and 169).The biodiversity of the yeast strains were studied by 26S rDNA D1/D2 domain,5.8S-ITS region sequence analysis and morphological analysis.4 species from 3 genera were recognized,includingCryptococcus magnus,Cryptococcus uzbekistanensis,Rhodosporidiobolus ruineniae and Hanseniaspora uvarum.In addition,H.uvarumwas only found from the clone R5,bothC.uzbekistanensisandR.ruineniaewere only isolated from clone ISV-FV5,whileC.magnuswas found from both clones ISV-FV5 and 169.The results showed that different Cabernet Sauvignon clones consisted diverse yeast species from the grape surfaces.However,though the three clones from the same grape variety were growing under similar objective conditions,the compositions of yeast species on grape surfaces from different clones were obviously different.

Cabernet Sauvignon;yeast;26S rDNA D1/D2;5.8S-ITS;diversity

TS261.1

0254-5071（2017）06-0126-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.026

2017-04-07

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目（CARS-30-yz-1）；河南省自然科學基金項目（162300410330）；鄭州輕工業(yè)學院博士科研基金項目（2014bsjj006）；鄭州輕工業(yè)學院研究生科技創(chuàng)新基金項目（2016）；河南省科技攻關(guān)計劃項目（142102110061）

張俊杰（1984-），講師，博士，研究方向為微生物分類與分子生態(tài)學。

*通訊作者：劉崇懷（1965-），男，研究員，博士，研究方向為葡萄遺傳育種。