東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中華蜜蜂的感染性和壽命的影響

鄭壽斌 和靜芳 蘇松坤 李志國(guó)

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002）

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中華蜜蜂的感染性和壽命的影響

鄭壽斌 和靜芳 蘇松坤 李志國(guó)

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002）

為了探討東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中華蜜蜂工蜂的感染性和壽命的影響，用不同濃度梯度東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)溶液感染剛出房的中蜂，并置于恒溫箱內(nèi)（30℃、RH：70～80%）培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種14天后，與對(duì)照組相比，隨著感染濃度的升高，感染濃度較高組的孢子感染量和感染率顯著高于感染濃度較低組（P）；而根據(jù)每天記錄的蜜蜂死亡情況分析，與對(duì)照組相比，感染濃度越高，中蜂的死亡率出現(xiàn)顯著性差異的時(shí)間更早，這說(shuō)明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中蜂壽命有影響。

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)；中蜂；感染；壽命

蜜蜂微孢子蟲(chóng)病是由微孢子蟲(chóng)引起的蜜蜂慢性傳染性病害，現(xiàn)在已經(jīng)遍布全球[1]。Zander在1909年首次在患病蜜蜂中腸上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)卵圓形小體，并確定該小體是寄生西方蜜蜂（Apis millefera）的微孢子蟲(chóng)孢子，并將這種寄生蟲(chóng)命名為蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosema apis）[2]。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)則是寄生于東方蜜蜂（Apis cerana）體內(nèi)的寄生蟲(chóng)[3]，1996年，瑞典烏普薩拉的瑞典農(nóng)業(yè)大學(xué)Dr.Ingemar Fries發(fā)現(xiàn)其與西方蜜蜂的蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子在形態(tài)大小、極絲圈數(shù)以及16S SSUr－RNA基因序列不同，將其命名為東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosema ceranae）[4]。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)是慢性的消化系統(tǒng)寄生蟲(chóng)，其可以影響意蜂個(gè)體的生理、行為、健康和壽命，而且可能改變蜂群中工蜂的勞動(dòng)分工、組織行為和數(shù)量[5]。被東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染的意蜂，對(duì)蔗糖表現(xiàn)得更為敏感，并且更不易與其他蜜蜂交哺飼喂食物[6]。近年來(lái)，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)有逐漸取代西方蜜蜂微孢子蟲(chóng)并成為感染西方蜜蜂的主要微孢子蟲(chóng)種類(lèi)的趨勢(shì)[7]，它被認(rèn)為是引起蜂群崩潰綜合癥（Colony Collapse Disorder，簡(jiǎn)稱(chēng)CCD）的一個(gè)主要原因之一[8]。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)新寄主西方蜜蜂的影響已得到廣泛的研究并已引起人們足夠的重視[9]，但東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)原宿主中蜂影響的研究卻相對(duì)較少。

本實(shí)驗(yàn)以意蜂來(lái)源的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)配成不同溶度梯度的孢子溶液，將其人工飼喂給剛出房的中蜂工蜂，并在實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)不同溶度梯度東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中蜂的感染量、感染率和壽命的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器

光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）；微量進(jìn)量器（上海醫(yī)用激光儀器廠）；血球計(jì)數(shù)板；低速大容量離心機(jī)DL-SB型（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ5200型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；人工智能氣候培養(yǎng)箱2RX-258D型（杭州錢(qián)江儀器設(shè)備有限公司）；超低溫冰箱（海爾集團(tuán)公司）；氣泵高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific中國(guó)有限公司）；MINI-8純水機(jī)（中國(guó)科爾頓公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）

1.2 蜜蜂

意蜂和中蜂蜂群均來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 不同濃度梯度東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中蜂感染性的影響

1.3.1.1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的提?。簭囊夥浞淙撼查T(mén)口抓取采集工蜂，拉取工蜂中腸并放入盛有1 ml無(wú)菌蒸餾水的離心管中，用研磨棒研碎，震蕩均勻，離心機(jī)3000 r/min離心5分鐘后，再用移液器去除上清液，加入1 ml無(wú)菌蒸餾水并震蕩，使孢子懸浮在水中。而后3000 r/min離心5分鐘，再用移液器移除上清液加1 ml無(wú)菌蒸餾水，使孢子懸浮在水中。接著配置25%、50%、75%和100%的Percoll溶液，利用Percoll梯度離心技術(shù)，將孢子懸浮液加入梯度濃度的Percoll溶液上，4℃，5000 r/min離心20分鐘。用移液器移除上清液，加入1 ml無(wú)菌蒸餾水并震蕩，使孢子懸浮在水中。最后離心機(jī)10000 r/min離心5分鐘，再用移液器移除上清液，用1 ml無(wú)菌水懸浮孢子蟲(chóng)，即可得到純化后的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)溶液。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，即可得到純化孢子蟲(chóng)的濃度。

1.3.1.2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的感染：用50%的蔗糖溶液將純化后的孢子蟲(chóng)溶液配制成五個(gè)濃度梯度：1/2×103個(gè)/μl、3/2×103個(gè)/μl、1/2×104個(gè)/μl、3/2×104個(gè)/μl、1/2×105個(gè)/μl，用不同濃度梯度孢子溶液以及50%的蔗糖溶液分別飼喂已準(zhǔn)備好的中蜂，每只蜜蜂飼喂2 μl。將處理后中蜂放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（30℃、RH:70～80%）。到第14天，將中蜂中腸拖出，研磨，離心配置成100 μl孢子液，再稀釋100倍，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每只中蜂感染孢子數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析各感染梯度的中蜂孢子感染量和感染率。

1.3.2 不同濃度梯度東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染對(duì)中蜂壽命的影響

采用上述方法提取東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)并感染中蜂，將中蜂放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（30℃、RH:70～80%）。每天記錄中蜂的死亡數(shù)量，直至所有中蜂死亡，統(tǒng)計(jì)分析各感染梯度中蜂的死亡率。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

各感染梯度的中蜂感染孢子量、感染率和死亡率均用SPSS軟件的LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

不同感染梯度孢子感染中蜂14天后，得到中蜂感染孢子量如下圖1：對(duì)照組中蜂不感染，3×104個(gè)/μl、105個(gè)/μl感染組中蜂之間孢子感染量差異不顯著（P）；3×104個(gè)/μl感染組與103個(gè)/μl、3×103個(gè)/μl、104個(gè)/μl感染組之間孢子感染量差異極顯著（P）；105個(gè)/μl感染組與103個(gè)/μl感染組之間孢子感染量差異極顯著（P），與3×103個(gè)/μl、104個(gè)/μl感染組之間孢子感染量差異顯著（P）。結(jié)果表明，在一定的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染濃度梯度范圍內(nèi)，隨著孢子感染濃度的升高，微孢子蟲(chóng)對(duì)中蜂的感染量也升高，當(dāng)感染濃度達(dá)到3×104個(gè)/μl時(shí)，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中蜂的孢子感染量不再升高。

圖2 不同梯度東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)處理后中蜂的感染率（14d）

不同感染梯度孢子感染中蜂14天后，被感染中蜂感染率如圖2：對(duì)照組感染率為0，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，103個(gè)/μl感染組，與104個(gè)/μl感染組差異顯著（P），與3×104個(gè)/μl和105個(gè)/μl感染組差異極顯著（P）；3×103個(gè)/μl感染組與3×104個(gè)/μl感染組差異顯著（P），與105個(gè)/μl感染組差異極顯著（P）；104個(gè)/μl感染組與105個(gè)/μl感染組差異顯著（P）。結(jié)果表明，隨著孢子蟲(chóng)感染溶液濃度的增大，孢子蟲(chóng)對(duì)于中蜂的感染率隨之增大，當(dāng)孢子感染梯度為105個(gè)/μl時(shí)感染率達(dá)到100%。

圖3不同梯度東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)處理后中蜂的死亡率（14d）

不同孢子感染梯度的中蜂死亡率如圖3，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)培養(yǎng)到第9天時(shí)105個(gè)/μl感染組與對(duì)照組的死亡率差異顯著（P）；到第11天時(shí)，3×104個(gè)/μl感染組與對(duì)照組死亡率差異顯著（P），105個(gè)/μl感染組與對(duì)照組的死亡率差異極顯著（P）；第36天時(shí)，104個(gè)/μl感染組與對(duì)照組死亡率差異顯著（P）；第37天時(shí)，3×103個(gè)/μl感染組與對(duì)照組死亡率差異顯著（P）；而感染濃度最小的103個(gè)/μl感染組與對(duì)照組死亡率差異一直不顯著（P）。結(jié)果表明，隨著東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染濃度的增大，孢子蟲(chóng)對(duì)于中蜂的壽命影響越大。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染濃度范圍內(nèi)，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)被感染中蜂工蜂的孢子感染量和感染率，是隨感染濃度的增加而增加的，并且，當(dāng)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的感染濃度達(dá)到3×104個(gè)/ μl時(shí)孢子感染量達(dá)到最大，而當(dāng)感染濃度達(dá)到105個(gè)/ μl時(shí)感染率達(dá)到最大值100%。這一結(jié)果對(duì)于了解東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中蜂的感染性有重要的意義，并且，為進(jìn)一步研究東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)與中蜂的關(guān)系提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。而東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的感染濃度同樣對(duì)中蜂的壽命產(chǎn)生影響，濃度最高的3×104個(gè)/μl、105個(gè)/μl兩感染組的死亡率最早在第11天和第9天就顯著高于對(duì)照組，而感染濃度相對(duì)低的3×103個(gè)/μl、104個(gè)/μl組的死亡率分別到第36天和第37天才顯著高于對(duì)照組，而103個(gè)/μl死亡率與對(duì)照組則不出現(xiàn)顯著性差異。這表明，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)中蜂工蜂的感染濃度的越大，對(duì)中蜂工蜂的壽命影響越大。

由于生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)各生物間存在緊密的聯(lián)系，所以對(duì)于蜜蜂這種慢性寄生蟲(chóng)的研究需要更加全面。除了東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)與它的新宿主西方蜜蜂的關(guān)系研究外，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)對(duì)其他蜂種尤其是中蜂的作用機(jī)理更需要去深刻的研究。只有對(duì)于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)更為全面的了解，才能采取更加高效的措施來(lái)抑制它的感染，降低危害，并提高養(yǎng)蜂的經(jīng)濟(jì)效益。

[1]Fries I.Nosema apis-a parasite in the honey bee colony[J].Bee World，1993,74(1):5-19.

[2]Zander E.Tierische parasiten als krankenheitserreger bei der biene[J].Münchener Bienenzeitung，1909,31:196-204.

[3]Martin S J.The role of Varroa and viral pathogens in the collapse of honeybee colonies:a modelling approach[J].Journal of Applied Ecology，2001,38(5):1082-1093.

[4]Fries I,Feng F,Da Silva A,et al.Nosema ceranae n.sp.(Microspora,Nosematidae),morphological and molecuLar characterization of a microsporidian parasite of the Asian honey bee Apis cerana (Hymenoptera,Apidae)[J].European Journal of Protistology，1996,32(3):356-365.

[5]Holt H L,Aronstein K A,Grozinger C M.Chronic parasitization by Nosema microsporidia causes global expression changes in core nutritional,metabolic and behavioral pathways in honey bee workers (Apis mellifera)[J].BMC genomics，2013,14(1):799.

[6]Naug D,Gibbs A.Behavioral changes mediated by hunger in honeybees infected with Nosema ceranae[J].Apidologie，2009,40 (6):595-599.

[7]Klee J,Besana A M,Genersch E,et al.Widespread dispersal of the microsporidian Nosema ceranae,an emergent pathogen of the western honey bee,Apis mellifera[J].Journal of invertebrate pathology，2007,96(1):1-10.

[8]Oldroyd B P.What's killing American honey bees[J].PLoS biology，2007,5(6):168.

[9]Derede A,Courchamp F.Extinction thresholds in host-parasite dynamics[J].Annales Zoologici Fennici，2003,40(40):115-130.

The influence of Nosema ceranae to the life and infection of Apis cerana cerana

Zheng Shoubin，He Jingfang，Su Songkun，Li Zhiguo
（College of Bee Science,Fu jian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002）

To inquire into the infectivity of Nosema ceranae in colony and the influence of life of bees（Apis cerana cerana）infected by Nosema ceranae,We use the solution of different concentration Nosema ceranae to infect the newly emerge bees,which are grouply trained at constant temperature box（30℃,RH:70～80%）.The results found that 14 days after inoculation,compared with the control group,with the increase of concentration of infection,the amount of spore infection and the infection rate of higher concentration infection group is significantly higher than low concentration of infection group（P）.To analyze the number of the daily dead bees,Compared with the control group,the higher infection concentration group has the significantly mortality rate in earlier time.In a word,the Nosema ceranae definitely infect bees（Apis cerana cerana）and change their life.

Nosema ceranae;Apis cerana cerana;infection;life

福建省自然科學(xué)基金青年創(chuàng)新項(xiàng)目資助（NO.2016J05063）

鄭壽斌（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊鄯浔Ｗo(hù)，E-mail：863686642@qq.com

李志國(guó)，博士，講師，主要從事蜜蜂科學(xué)研究，E-mail:zhiguo.li@fafu.edu.cn