?？莆锓N胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)研究進(jìn)展

羅建椿，邱立華，范新陽(yáng)，苗永旺*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201;2.云南省怒江州蘭坪縣畜禽品種改良站，云南 蘭坪 671400)

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文獻(xiàn)綜述

牛科物種胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)研究進(jìn)展

羅建椿1, 2，邱立華1，范新陽(yáng)1，苗永旺1*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201;2.云南省怒江州蘭坪縣畜禽品種改良站，云南 蘭坪 671400)

胰島素誘導(dǎo)基因1編碼蛋白(INSIG1)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是調(diào)控脂代謝的重要因子。INSIG1主要通過(guò)調(diào)控固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)和3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)來(lái)影響脂質(zhì)代謝。越來(lái)越多的研究結(jié)果揭示了INSIG1在生物體內(nèi)作用的復(fù)雜性。本文綜述了INSIG1與SREBP和HMGR之間在脂代謝調(diào)控過(guò)程中的相互作用機(jī)制、INSIG1的結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控、INSIG1對(duì)?？苿?dòng)物泌乳、生長(zhǎng)等性狀的影響。

胰島素誘導(dǎo)基因1；固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白；3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；表達(dá)調(diào)控；泌乳性狀；基因多態(tài)性

胰島素誘導(dǎo)基因(Insulin induced gene，INSIGs)編碼蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種在脂肪代謝與脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白。1993年，Diamond等[1]最早從再生肝臟中克隆獲得了INSIG1基因。自INSIG1被發(fā)現(xiàn)后，其功能一直未知，直到2002年，Yang等[2]發(fā)現(xiàn)其能夠有效的阻止SREBP家族成員的激活，INSIG1的功能及其作用機(jī)制才開(kāi)始為研究人員所關(guān)注。INSIGs基因有INSIG1和INSIG2兩種亞型，且INSIG2在哺乳動(dòng)物中含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本INSIG2a和INSIG2b，但兩者編碼蛋白質(zhì)相同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，INSIGs基因的表達(dá)受胰島素和攝入的游離脂肪酸、葡萄糖和其它營(yíng)養(yǎng)素的調(diào)控。INSIG1蛋白為鑲嵌于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)膜上的蛋白質(zhì)，其親水性的N端和C端延伸段伸入胞漿，其余大部分都是位于跨膜區(qū)，共有6個(gè)跨膜螺旋錨定在ER膜上，并且含有5-16個(gè)氨基酸構(gòu)成的親水環(huán)[3]，其中第3和第4個(gè)跨膜區(qū)對(duì)INSIG1與羥固醇/SCAP復(fù)合體的結(jié)合比較重要，因此，INSIGs蛋白又被稱為羥固醇結(jié)合蛋白[4]。Lee等[5]發(fā)現(xiàn)，INSIG1蛋白的跨膜區(qū)1處有一個(gè)甘氨酸殘基，為gly-95，這個(gè)氨基酸對(duì)于INSIG1蛋白調(diào)控固醇的功能起重要作用。INSIG1和INSIG2的蛋白序列高度相似，均為ER上的膜蛋白。在人類中INSIG1和INSIG2的氨基酸序列具有59%的相似性，跨膜區(qū)相似性更高，達(dá)到85%[6-7]。它們具有相似的功能，都參與了與固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白(Sterol-regulatory element binding proteins，SREBP)及SREBP裂解活化蛋白(SREBP cleavage activating protein, SCAP)的結(jié)合。它們以INSIG-SCAP-SREBP復(fù)合物的形式固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在細(xì)胞內(nèi)固醇類物質(zhì)的參與下，調(diào)控SREBP的活化，從而反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外源性膽固醇的攝取[8]。INSIG2與INSIG1相比，INSIG2缺少了INSIG1的N端的50個(gè)氨基酸殘基，但I(xiàn)NSIG1的降解速度較快，這與它們所含的氨基酸殘基不同有關(guān)[9]。

INSIG1具有多種生物功能，它參與了生物體內(nèi)的脂質(zhì)代謝，蛋白調(diào)控，與牛科物種的生長(zhǎng)發(fā)育、泌乳及胴體重等性狀有關(guān)。

1 INSIG1作用機(jī)制

INSIG1主要通過(guò)兩個(gè)路徑發(fā)揮作用：一個(gè)是通過(guò)INSIG1-SCAP-SREBP的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)衡調(diào)節(jié)，另一個(gè)是通過(guò)3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶泛素化降解調(diào)節(jié)(圖1)。其中SCAP的固醇敏感結(jié)構(gòu)域(sterol sensing domain，SSD)和還原酶第二跨膜區(qū)內(nèi)的一個(gè)四肽序列YIYF是在固醇誘導(dǎo)下與INSIGs結(jié)合所必需的[10-12]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，INSIG1通過(guò)結(jié)合SCAP阻止SREBP/SCAP復(fù)合體從ER轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體[6]。SREBP在哺乳動(dòng)物中是參與固醇和脂肪酸合成調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子，直接參與調(diào)控與膽固醇、甘油三酯、脂肪酸及磷脂的生物合成及攝取過(guò)程中相關(guān)的30多個(gè)基因的表達(dá)[13]。固醇和脂肪酸對(duì)維持機(jī)體基本生理功能和正常代謝十分重要，它們?cè)诰S持細(xì)胞穩(wěn)定性、流動(dòng)性等功能方面發(fā)揮重要作用。SCAP既是SREBP的護(hù)送者，也是固醇感應(yīng)器之一。Gong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)INSIG1蛋白第205位的Asp突變?yōu)锳la時(shí)，INSIG1將不能與SCAP結(jié)合，揭示INSIG1的205位Asp是調(diào)控SREBP蛋白所必需的。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平升高時(shí)，INSIG1與SCAP相互作用，以INSIG1-SCAP-SREBP復(fù)合物的形式固定在內(nèi)置網(wǎng)上，這時(shí)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)從ER運(yùn)向高爾基體(Golgi)的一種介導(dǎo)蛋白——細(xì)胞質(zhì)被膜復(fù)合體II(coat protein complex II，COPII)不能結(jié)合到SCAP，因此SCAP-SREBP復(fù)合體不能被COPII蛋白轉(zhuǎn)移到高爾基體上；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇耗盡時(shí)，INSIG1與SCAP的親和力降低，從復(fù)合物中解離，SCAP護(hù)送SREBP從ER轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，SREBP前體在高爾基體內(nèi)被兩個(gè)特異的蛋白酶依次加工，裂解成為成熟的SREBP活性片段，進(jìn)入細(xì)胞核，與多個(gè)靶基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的類固醇反應(yīng)元件(steroid hormone response elements, SREs)結(jié)合，從而行使其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，促進(jìn)固醇和脂肪酸生物合成中相關(guān)基因的表達(dá)[15-17]。之后，游離的INSIG1蛋白被迅速泛素化降解，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)固醇再次積累到一定水平時(shí)，INSIG1蛋白泛素化過(guò)程停滯，INSIG1蛋白質(zhì)濃度趨于穩(wěn)定[18]。這主要是因?yàn)闊o(wú)固醇細(xì)胞中INSIG1蛋白的降解需要泛素連接酶gp78的參與，這種酶與INSIG1結(jié)合的親和力要高于INSIG2，固醇可以通過(guò)從INSIG1上置換出gp78，從而避免INSIG1蛋白泛素化而被降解[19]。Lee等[18]研究發(fā)現(xiàn)，INSIG1蛋白的Ser-149位點(diǎn)會(huì)促進(jìn)其泛素化降解。Yang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，固醇含量較高時(shí)，固醇可與SCAP結(jié)合使其構(gòu)象改變，促進(jìn)INSIG1與SCAP結(jié)合，從而阻止SCAP-SREBP由ER到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，使SREBP裂解成熟過(guò)程受阻。

此外，INSIG1是多個(gè)SREBPs的作用目標(biāo)，即它本身也是SREBP作用的靶基因，其mRNA的表達(dá)水平受到SREBP的調(diào)節(jié)。SREBP可以調(diào)控INSIG1基因的啟動(dòng)子。研究發(fā)現(xiàn)，INSIG1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游380bp發(fā)現(xiàn)了固醇應(yīng)答元件[20]。羥固醇可以下調(diào)INSIG1基因的表達(dá)，降固醇藥物可上調(diào)其表達(dá)[21]，而不飽和脂肪酸可以穩(wěn)定INSIG1水平，使它不受泛素化的影響[22]。在動(dòng)物細(xì)胞中，低滲休克和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以通過(guò)SREBP對(duì)膽固醇的抑制降低INSIG1的水平[9]。

另一方面，作為總固醇代謝的最重要的酶之一，3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，HMGR)是ER上總固醇合成的限速酶[23]。HMGR可以產(chǎn)生甲羥戊酸，甲羥戊酸可以轉(zhuǎn)化成固醇和其它產(chǎn)物。HMGR的表達(dá)受到多級(jí)復(fù)雜的調(diào)控，防止生成過(guò)多的總固醇，維持體內(nèi)總固醇的平衡。INSIG1在高固醇水平下通過(guò)與HMGR的SSD結(jié)合而促進(jìn)它的降解，而在固醇較低水平時(shí)，HMGR降解比較緩慢，HMGR含量和活性增加，促進(jìn)總固醇合成[11]。Sever等[24]建立了不能表達(dá)INSIG1的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)固醇抑制SREBP的過(guò)程明顯變慢，而這個(gè)過(guò)程和HMGR的降解過(guò)程可以通過(guò)INSIG1的過(guò)表達(dá)而恢復(fù)，揭示INSIG1是還原酶泛素化降解所必需的。SCAP和HMGR與INSIG1的結(jié)合是競(jìng)爭(zhēng)性的，二者不能同時(shí)結(jié)合INSIG1蛋白。Kuwabara等[25]通過(guò)研究SCAP和HMGR的序列發(fā)現(xiàn)，SCAP與HMGR在跨膜區(qū)上高度相似，跨膜區(qū)有與INSIG1結(jié)合的SSD。Lee等[26]將SSD區(qū)域基因突變或敲除時(shí)，INSIG1不能與SCAP和HMGR結(jié)合，導(dǎo)致INSIG1既不能將SREBP固定在ER上，也不能改變HMGR泛素化降解速度。然而，在酵母中，INSIG1通過(guò)與SSD結(jié)合而抑制HMGR的泛素化降解[27]。HMGR在轉(zhuǎn)錄水平上還受SREBP2的調(diào)控。當(dāng)機(jī)體需要甲羥戊酸衍生產(chǎn)物增加時(shí)，SREBP2會(huì)結(jié)合到HMGR的啟動(dòng)子上，激活其轉(zhuǎn)錄[28]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，INSIG1的作用也受其它因素的影響。它最早在從肝臟中分離出來(lái)時(shí)，就被發(fā)現(xiàn)具有胰島素敏感性，它的表達(dá)水平隨著胰島素水平的改變而改變。當(dāng)肝臟的胰島素水平上升時(shí)，INSIG1基因的mRNA表達(dá)水平升高，而當(dāng)胰島素水平下降時(shí)，INSIG1基因的mRNA水平也會(huì)下降[1]。此外，葡萄糖水平也會(huì)影響INSIG1基因的表達(dá)。謝紅艷等[29]發(fā)現(xiàn)，低濃度的葡萄糖可以上調(diào)3T3-L1細(xì)胞中INSIG1的mRNA水平，從而抑制脂肪細(xì)胞早期脂質(zhì)合成和分化。INSIG1還可能通過(guò)調(diào)節(jié) PPARγ的表達(dá)，參與糖代謝的調(diào)控。這些研究揭示INSIG1基因可能處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心位置，調(diào)控多種因素介導(dǎo)細(xì)胞脂代謝。

圖1 INSIG1功能機(jī)制圖(引自Dong等[12])

2 INSIG1基因的結(jié)構(gòu)及表達(dá)

普通牛的INSIG1基因(AC_000161)全長(zhǎng)約13.2kb，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，定位于4號(hào)染色體(BAT4)。外顯子1的全部和外顯子2的前23 bp位于5’UTR，外顯子6的后1845bp位于3’UTR，基因結(jié)構(gòu)如圖2所示。牛INSIG1基因(NM_001077909)CDS區(qū)長(zhǎng)831bp，編碼276個(gè)氨基酸。序列比對(duì)分析，牛INSIG1基因與山羊INSIG1基因的相似性最高[30]。INSIG1在水牛和奶牛的乳腺組織中高度表達(dá)，且奶牛泌乳期表達(dá)量是干奶期的12倍[31, 32]。對(duì)人17個(gè)組織的基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，INSIG1基因在肝臟中高度表達(dá)，而INSIG2則在肌肉、肺和大腦等各組織中廣泛表達(dá)[33]。

圖2 普通牛(Bos taurus)INSIG1基因結(jié)構(gòu)注：方框?yàn)橥怙@子，灰色方框?yàn)榉欠g區(qū)，黑色方框?yàn)榫幋a區(qū)，橫線為內(nèi)含子。

3 INSIG1對(duì)?？莆锓N性狀的影響

Bionaz等[31]基于對(duì)奶牛多個(gè)泌乳時(shí)期乳腺中54個(gè)與乳脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平分析，推測(cè)出乳脂代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，提出SREBP在泌乳過(guò)程乳脂代謝網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。此外，Xu等[34]在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SREBP1后，顯著提高了乳脂合成過(guò)程中多個(gè)重要基因的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞中甘油三酯以及C16：0與C18：0含量升高，揭示了SREBP在乳脂合成調(diào)控的關(guān)鍵作用。而INSIG1是調(diào)控SREBP的重要蛋白，揭示INSIG1在乳脂合成中發(fā)揮了重要作用。王苗等[13]成功構(gòu)建了INSIG1基因的超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)參與脂肪酸從頭合成基因(ACCα、FASN)及去飽和基因(SCD1)的mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)，參與甘油三酯合成的關(guān)鍵基因(GPAM、DGAT2)的mRNA表達(dá)量顯著下降，揭示INSIG1對(duì)山羊乳腺脂質(zhì)代謝具有重要作用。Wu等[32]檢測(cè)了水牛INSIG1基因在10個(gè)組織中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，INSIG1在乳腺中表達(dá)量最高，其次是肝，認(rèn)為INSIG1在乳脂合成的調(diào)控中起到重要作用。南雪梅[35]通過(guò)熒光定量檢測(cè)了奶山羊乳腺組織不同泌乳時(shí)期INSIG1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在泌乳35天時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值，揭示INSIG1基因在奶山羊泌乳過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，進(jìn)一步研究INSIG1的遺傳變異，分析它們與牛、羊的泌乳性狀的關(guān)聯(lián)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

INSIG1除了對(duì)泌乳性狀有影響外，還與家畜其他經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)。INSIG1是脂肪和膽固醇合成反饋調(diào)節(jié)的重要成分，對(duì)細(xì)胞中的脂質(zhì)自穩(wěn)態(tài)的維持有重要作用，它可以控制前脂肪細(xì)胞分化、成熟等過(guò)程，防止脂肪細(xì)胞分化過(guò)度或分化不良，從而對(duì)于脂肪沉積、肥胖的控制可能都有意義[36]。Liu等[37]通過(guò)PCR-RFLP和DNA測(cè)序的方法，檢測(cè)了秦川牛INSIG1基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，又與體長(zhǎng)、體高、臀寬，出欄體重和胴體重等性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在A4366G位點(diǎn)是GG基因型的牛個(gè)體臀更寬，胴體更重，T4534C位點(diǎn)是CC基因型的牛個(gè)體身體更長(zhǎng)，臀更寬以及T5001C位點(diǎn)是CC基因型的牛個(gè)體身體更長(zhǎng)。Sun等[38]通過(guò)DNA池、PCR-RFLP、PCR-SSCP和DNA測(cè)序的方法，檢測(cè)了643頭南陽(yáng)牛，共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中4個(gè)位于編碼區(qū)，同時(shí)將多態(tài)性位點(diǎn)與體重進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有顯著的相關(guān)性。

4 INSIG1研究的問(wèn)題與展望

眾多研究結(jié)果表明，INSIG1基因在脂質(zhì)和糖代謝中發(fā)揮了重要的生理功能。它與動(dòng)物的泌乳性狀以及其它經(jīng)濟(jì)性狀存在一定相關(guān)性，而且與肥胖、糖尿病等多種疾病有關(guān)，但當(dāng)前在INSIG1基因的研究和應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題亟待進(jìn)一步解決。比如，INSIG1基因是否還有別的亞型；INSIG1與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)性在水牛及其它?？莆锓N所做的研究不多；INSIG1影響動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的研究較少，其分子機(jī)制也還不清楚。水牛奶營(yíng)養(yǎng)全面，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于荷斯坦牛奶，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)認(rèn)為水牛是最具開(kāi)發(fā)潛力和開(kāi)發(fā)價(jià)值的家畜。由于該基因與泌乳性狀密切相關(guān)，因此我們可以針對(duì)奶水牛的泌乳性狀做關(guān)聯(lián)分析，同時(shí)可以利用生物信息學(xué)來(lái)預(yù)測(cè)水牛INSIG1基因的遺傳變異，為改良和培育具有優(yōu)良泌乳性能的品種提供參考。此外，有關(guān)INSIG1基因編碼區(qū)多態(tài)性的研究以及本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)克隆INSIG1基因，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)較為保守，因此，我們有必要對(duì)其非編碼區(qū)進(jìn)行相關(guān)研究。

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Research Advances of Insulin iInduced Gene 1 (INSIG1) in Bovine Species

LUO Jian-chun1,2,QIU Li-hua1,FAN Xin-yang1,MIAO Yong-wang1*

(1.FacultyofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201;2.LivestockandPoultryBreedingStationofLanpingCountyinNujiang,Lanping,Yunnan671400)

INSIG1protein,encoded by insulin induced gene 1(INSIG1),which located in the membrane of endoplasmic reticulum,is an important factorparticipatedin the regulation of lipid metabolism.INSIG1 playroles in lipid metabolism through regulating sterolregulatory element binding proteins(SREBP) and 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase(HMGR).An increasing number of studies have uncovered the complexity of INSIG1 functions in vivo.In this paper,we reviewed the mechanism of the interaction among INSIG1,SREBPand HMGRin the regulation of lipid metabolism,the structure and expression regulation of INSIG1,and the effects of INSIG1 on the lactation and growth traits in bovine species.

INSIG1;sterol regulatory element binding proteins;3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase;expressionregulation;lactation traits;gene polymorphism

7-02-22

2017-03-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460582；30660024)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2014FA032;2007C0003Z)

羅建椿(1976-)，男，畜牧師，主要從事畜禽品種改良工作。

*通訊作者：苗永旺(1964-)，男，內(nèi)蒙古通遼人，教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究。

S813.7

A

1001-9111(2017)03-0031-05