超順磁性氧化鐵納米顆粒應用于干細胞定向歸巢中的研究進展

Yerkintay Guliya， 黃浙勇， 王齊兵

復旦大學附屬中山醫(yī)院心內科，上海 200032

·綜 述·

超順磁性氧化鐵納米顆粒應用于干細胞定向歸巢中的研究進展

Yerkintay Guliya， 黃浙勇*， 王齊兵

復旦大學附屬中山醫(yī)院心內科，上海 200032

干細胞在組織器官的自我更新和修復過程中起重要作用。在外加磁場的作用下，用納米磁鐵顆粒標記干細胞，可增加干細胞的定向歸巢和存留，從而放大干細胞的修復效應。本文就納米磁鐵顆粒靶向干細胞的原理，以及其在各種病理模型應用的研究進展作一綜述。

超順磁性氧化鐵納米顆粒；磁靶向；干細胞; 移植；磁性納米離子

干細胞治療是再生醫(yī)學繼受損組織自我修復或者藥物治療失敗后的一種治療途徑。如何有效地將干細胞聚集于病灶是干細胞治療進展最大的障礙之一。在特定條件下，干細胞可以通過其多能性特點，誘導未分化的細胞分化為特定細胞。干細胞可以在心肌梗死模型中誘導心肌細胞再生，也可在支架術后血管中誘導內皮細胞再生及新生血管形成[1-2]，還可應用于視網膜變性、脊髓損傷、腦部創(chuàng)傷等[3-4]。隨著細胞療法在醫(yī)學中的應用，干細胞修復損傷器官和重建器官也得到發(fā)展，給在積極等待器官移植的患者帶來希望。本文將討論磁靶向的基本原理及其應用進展作一綜述。

1 超順磁性氧化鐵納米顆粒

隨著時間推移，細胞在損傷部位停留的數量越來越少。這是目前細胞治療面臨的重要問題之一。而給藥困難、藥物劑量缺乏個體化等均可導致干細胞的低效植入[5]。磁性納米顆粒在診斷和治療疾病方面起重要作用[6-7]。此外，對于臨床應用來說，MRI因無輻射，且不使用放射性造影劑，所以比起CT、PET-CT或X線，更有利于同一患者數據的縱向采集，且能夠提高軟組織和硬組織在不同生理或病理狀態(tài)下的成像，而其高分辨率有助于細胞的定量[7]。

2 磁靶向定位的基本原理

干細胞的磁靶向歸巢依賴于磁場的內部或外部磁場和其對磁活性載體的影響力。磁性反應性粒子的原子可以平行排列于所施加的磁場[8]。超順磁性不存在磁滯現(xiàn)象，即去掉外磁場后，磁性很快就消失，這一現(xiàn)象可以防止顆粒在磁場消失后繼續(xù)聚集。在室溫下，鐵磁體的磁化率較超順磁體高，而超順磁性納米顆粒聚集時的粒子相對較少，在處理和給藥中也可以很好的進行控制[6,8-9]。

2.1 磁性納米顆粒相關理化性質 超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs)結構的核心層通常由磁鐵礦(Fe3O4)或磁赤鐵礦(γ-Fe2O3)構成。兩者均為自然磁鐵，這意味著SPIONs可以被永磁體吸引。超順磁性磁鐵顆粒小于臨界尺寸時具有單疇結構。一般將超順磁性磁鐵顆粒分類為：50～180 nm的SPIONs，10～50 nm的超小型超順磁性氧化鐵納米粒子(USPIONs)，小于10 nm的超順磁性氧化鐵納米粒子(VSPIONs)[10-11]。

SPIONs的不良反應少[12]，導致血管閉塞的危險小。由于體內有鐵蛋白有，故SPIONs的生物相容性較好，也可以通過用有機或無機聚合物涂層包裹核心層來進一步實現(xiàn)生物相容性。 Gastromark(50 nm)也被稱為Lumirem，在1996年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用作口服造影劑。有關Ferumoxytol(20～50 nm)干細胞的磁性靶向歸巢遞送的研究較深入。其也被稱為Feraheme，在2009年被美國FDA批準用于治療成人腎臟疾病伴缺鐵性貧血。1996年，F(xiàn)DA也批準另一類適用于在肝臟病變MRI的造影劑——菲立磁(Feridex)，但后來因其市場需求低逐漸被淘汰[13]。

磁性納米顆粒的合成途徑有多種，包括共沉淀法、熱液合成法、熱分解法、水熱法、微乳化法等。目前，臨床用磁性納米顆粒最常用的的制備方法是共沉淀法。共沉淀法的原理是在封閉無氧條件下，采用化學計量比的二價和三價鐵離子，在特定pH值及穩(wěn)定劑存在的情況下，通過水解等反應完成制備，然后用高溫熱分解制備技術，使磁性氧化鐵納米顆粒結晶度更高、磁響應性更強、單分散性更好、表面修飾結構更清晰[14]。

2.2 磁場梯度 磁場梯度的作用是將干細胞/ SPIONs復合物吸引至在靶向病理位點并定位于此。磁場和磁場梯度常由外部放置的磁體來產生，但是這種設置有局限性，即磁流密度在磁極面處最大，并隨著磁體的距離而越來越小[15]。因此，如果靶向治療范圍超出磁場(深部組織)范圍，轉染SPIONs的細胞就不會被吸引。這種限制促使了可磁化植入物的發(fā)展，將磁體放置在組織內并使植入物周圍產生高梯度磁場，但在心臟、肝臟、腎臟等較深的組織仍不可行[16]。

復旦大學和上海大學的聯(lián)合課題組曾開發(fā)一種將磁場聚焦在離磁體一定距離處的磁性系統(tǒng)[15-16]。該課題組利用小直徑試管模仿血管，以不同速度注射磁性標記的骨髓間充質干細胞(MSC)，當細胞流過管中磁性帶時，特定的磁性裝置可以捕獲距離磁場起源5 mm處的細胞。其中，SPIONs標記的細胞數量隨著磁通密度呈正向變化，而隨著流動速度呈負向變化。外部永久磁場的另一個固有特征是沿其切向軸不均勻性分布。在圓柱形磁體中，磁場在遠離磁體中心的特定距離處產生圓形吸引環(huán)，這種均勻性和耗散現(xiàn)象若可被操控，便有利于使用SPIONs標記的細胞實現(xiàn)臨床治療[17]。

2.3 納米顆粒的穩(wěn)定化 為了能更好地調控納米顆粒，需要對其表面進行修飾。表面修飾之前的納米顆粒在空氣中的不穩(wěn)定性導致其極易氧化。納米顆粒的高表面能極易使其發(fā)生沉積團聚，導致其在體內易被網狀內皮系統(tǒng)清除[8,10,18-19]。高濃度的鐵離子仍可產生局部毒性。對SPIONs的表面進行修飾后，能夠更好地穩(wěn)定納米顆粒、增加其生物相容性和反應活性。目前已經有多種聚合物材料和無機材料用于包被納米顆粒，如表面活性劑、稀有金屬、二氧化硅、碳涂層、纖維素、殼聚糖等[8]。其中，最常見的3種SPIONs涂層類型為：聚乙烯乙二醇(PEG)、淀粉、葡聚糖[20-21]。

3 SPIONs在靶器官和病理模型中的應用

近年來，多項研究[22-28]將SPIONs包括VSPIONs、菲立磁、多聚-L-賴氨酸(PLL)通過多種干細胞應用于脊髓損傷、心肌梗塞、血管損傷等的大鼠模型，證實其促進細胞再生的效果(表1)。

表1 SPIONs標記干細胞治療的病理模型

3.1 間充質干細胞與脊髓損傷 對于人類脊髓損傷，目前尚無有效的治療方法。肢體癱瘓、疼痛、痙攣、自主運動和(或)感覺能力缺失與脊髓損傷相關[22]。Tukmachev等[22]將MSC鞘內注射于大鼠脊髓損傷部位，并分為3個實驗組：PLL-SPIONs標記的MSC加磁場組、未標記的MSC加磁場組和無磁場的標記MSC組。研究人員將兩個圓柱形NdFeB磁體的相同磁極面面向彼此，將磁場聚焦于目標區(qū)“捕獲區(qū)域”，并有效地誘導聚焦的細胞遷移到中性磁場區(qū)。最終計算在損傷位點的細胞數目與在脊髓手術范圍內的細胞總數的比值，標記的MSC加磁場組為45%，而未標記的MSC加磁場組為14%、無磁場的標記的MSC組為13%。

3.2 循環(huán)祖細胞與血管損傷 血管內皮損傷是心血管疾病的主要起因之一。Kyrtatos等[27]通過應用外部磁性裝置，使祖細胞靶向至血管內皮損傷部位，以幫助內皮層再生。研究人員將參與血管內皮再生和缺血后新生血管形成的CD133+內皮祖細胞(EPCs)靶向注入至SD大鼠的頸總動脈中導管的插入部位，以期預防或減少血管成形術后再狹窄或由于瘢痕組織形成而導致的血管再閉塞的發(fā)生率[29]。結果表明，與不使用SPIONs的細胞相比，CD133+細胞植入到損傷部位的系數增加了5.4倍。

3.3 干細胞與心臟再生 目前應用干細胞治療心臟病的障礙之一是難以將干細胞長期停留在所需部位。干細胞短期在心臟靶位點的停留率僅為10%，并且隨著時間的延長逐漸下降。干細胞移位主要由冠狀動脈血流和心臟收縮而造成[30]。Gutova等[30]將Feraheme、硫酸肝素(H)和硫酸魚精蛋白(P)結合形成FHP復合物，再將這些復合物與心臟來源的干細胞(CDC)共培養(yǎng)后，注射至已進行心臟缺血再灌注處理大鼠的冠狀動脈內。結果顯示，磁化CDC細胞組在靶位點的細胞停留率比未磁化組高3倍，且磁化CDC細胞組心臟形態(tài)、心肌存活力較其他組更佳。

4 磁性雙功能細胞銜接器

雙特異性抗體和可生物降解鐵納米顆粒的組合近年來成為靶向干細胞治療的新熱點。雙特異性抗體的雙重特異性使其可結合多種標志物。Luma等[31]用造血細胞標志物CD45和缺血性損傷標志物肌球蛋白輕鏈(MLC)-1標記雙特異性抗體，使用該抗體制備的干細胞增強了對損傷心肌的特異性歸巢，并可顯著改善心臟功能。

磁性雙功能細胞銜接器(MagBICE)同樣有兩種類型的抗體[31-32]，其核心為Feraheme。抗體-納米顆粒結合物可以結合損傷細胞或目的細胞的表面抗原，從而起到靶向治療的目的，同時也有利于磁靶向和MRI成像。相對于其他鐵納米顆粒，F(xiàn)eraheme的游離鐵含量非常少，使其生物相容性增加，且其表面的羧化葡聚糖涂層能增加MagBICE與抗體結合的反應活性[41]。Cheng等[26]將抗CD34(干細胞標志物)和抗MLC抗體(缺血損傷標志物)結合于超順磁納米顆粒，使內源性CD34+干細胞歸巢至損傷的心肌，并用1.3T磁場MRI觀察。結果表明，干細胞作用處心肌功能得到改善、心肌瘢痕減少，且梗死后室壁厚度未減小。上述說明MagBICE是可以將分子、物理靶向和無創(chuàng)成像結合為一體，既可自由組合，也容易合成。

5 總結與展望

由于磁性粒子在體內易聚集，從而影響粒子的磁性與分散性，且磁場作用強度和時間等不可控，如何促進磁靶向干細胞的歸巢和其在靶器官的長期停留還需進一步研究。在該技術應用于臨床前，必須保證磁性納米顆粒無毒、環(huán)保、可生物降解、與表面修飾相容，在體內保持穩(wěn)定性，不影響干細胞功能，且在足夠的劑量下有望有效診斷或治療疾病。因此，將磁性納米顆粒應用于臨床前還須進行大量動物研究和進行長期的生物相容性評估。目前大多數磁性納米顆粒動物研究為小鼠等小動物模型，為了更準確地反映其在人體內的反應、磁場大小、干細胞劑量等問題，還需要進行與人類生理特征相似的大型動物的模型研究。與其他金屬納米顆粒相比，SPIONs具有較好的生物相容性及可降解性。但是，SPIONs治療劑量及其體內的免疫反應、炎癥反應等報道較少[9,11]。

綜上所述，為患者提供多樣的、個體化的干細胞靶向治療和診斷是再生醫(yī)學最前沿的研究之一。由于SPIONs的多功能性以及其MRI兼容性，其有解決干細胞治療后靶位點細胞存活數量少及拓寬干細胞療法臨床應用范圍的潛能。

[1] KRISHNA K A, KRISHNA K S, BERROCAL R, et al. Myocardial infarction and stem cells[J]. J Pharm Bioallied Sci, 2011, 3(2):182-188.

[2] LEEPER N J, HUNTER A L, COOKE J P,et al. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells[J]. Circulation, 2010, 122(5):517-526.

[4] SHINOZUKA K, DAILEY T, TAJIRI N, et al. Stem cell transplantation for neuroprotection in stroke[J]. Brain Sci, 2013, 3(1): 239-261.

[5] VERFAILLIE C M. Optimizing hematopoietic stem cell engraftment: a novel role for thrombopoietin[J]. J Clin Invest, 2002, 110(3): 303-304.

[6] SENSENIG R, SAPIR Y, MACDONALD C, et al. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo[J]. Nanomedicine, 2012, 7(9):1425-1442.

[7] FRANGIONI J V, HAJJAR R J.Invivotracking of stem cells for clinical trials in cardiovascular disease[J].Circulation. 2004, 110(21):3378-3383.

[8] ARBAB A L, JORDAN E K, WILSON L B, et al.Invivotrafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells[J]. Hum Gene Ther, 2004, 15(4):351-360.

[9] MARKIDES H, ROTHERHAM M, EI HAJ A J. Biocompatibility and toxicity of magnetic nanoparticles in regenerative medicine[J]. Nanomater. 2012, 2012:1-11.

[10] AITZIBER L C, DANIEL O, SANDRA M O,et al. Engineering iron oxide nanoparticles for clinical settings[J]. Nanobiomedicine, 2014, 1(2):1-20.

[11] SINGH N, JENKINS G J, ASADI R, et al. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION)[J]. Nano Rev, 2010，1(7)：10.

[12] MAHMOUDI M, SANT S, WANG B, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs): development, surface modification and applications in chemotherapy[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2011, 63(1-2):24-46.

[13] BULTE J W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies[J]. AJR Am J Roentgenol, 2009,193(2):314-325.

[14] XIE J, CHEN K, LEE H Y, et al. Ultrasmall c(RGDyK)-coated Fe3O4 nanoparticles and their specific targeting to integrin alpha(v)beta3-rich tumor cells[J]. J Am Chemi Soc, 2008, 130(24):7542-7543.

[15] PEI N, HUANG Z, MA W, et al.Invitrostudy of deep capture of paramagnetic particle for targeting therapeutics[J]. Magn Mater, 2009, 321(18):2911-2915.

[16] HUANG Z, PEI N, WANG Y, et al. Deep magnetic capture of magnetically loaded cells for spatially targeted therapeutics[J]. Biomaterials, 2010, 31(8):2130-2140.

[17] HUANG Z, SHEN Y, PEI N, et al. The effect of nonuniform magnetic targeting of intracoronary-delivering mesenchymal stem cells on coronary embolisation[J]. Biomaterials, 2013,34(38):9905-9916.

[18] CHEN J, HUANG N, MA B, et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2013,10,5(13):5976-5985.

[19] SUN S N, WEI C, ZHU Z Z,et al. Magnetic iron oxide nanoparticles : synthesis and surface coating techniques for biomedical applications[J]. Chin Phys,2014,23(3):13-31.

[20] Umut E. Surface modification of nanoparticles used in biomedical applications[J]. Mod Surf Eng Treat. 2013, 5(8):185-208.

[21] HUONG N T, GIANG L T K, BINH N T, et al. Surface modification of iron oxide nanoparticles and their conjuntion with water soluble polymers for biomedical application[J]. Phys Conf Ser, 2009,6(1):187-191.

[29] DANGAS G, KUEPPER F. Cardiology patient page. Restenosis: repeat narrowing of a coronary artery: prevention and treatment[J]. Circulation, 2002,105(22):2586-2587.

[30] GUTOVA M, FRANK J A, D’APUZZO M, et al. Magnetic resonance imaging tracking of ferumoxytol-labeled human neural stem cells: studies leading to clinical use[J]. Stem Cells Transl Med, 2013,2(10): 766-775.

[31] LUMA L G, DAVOLA P A, LEE R J, et al. The new face of bispecific antibodies: targeting cancer and much more[J]. Exp Hematol. 2006, 34(1):1-6.

[32] TANG J, SHEN D, ZHANG J,et al. Bispecific antibodies, nanoparticles and cells: bringing the right cells to get the job done[J]. Expert Opin Biol Ther, 2015,15(9):1251-1255.

[本文編輯] 姬靜芳

Research progress in magnetically targeted stem cell delivery with SPIONs

YERKINTAY Guliya, HUANG Zhe-yong*, WANG Qi-bing

Department of Cardiology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Stem cells play an important role in self-renewal and repair of tissues and organs. Under the influence of the external magnetic field, labeling the stem cells with magnetic nanoparticles can increase the directional homing and retention of the stem cells, thereby amplifying the repair effect of the stem cells. In this paper, the principle of magnetic nanoparticles targeting stem cells and its progress in the application of various pathological models are reviewed.

superparamagnetic iron oxide nanoparticles；magnetic targeting；stem cell; transplantation; magnetic nanoparticle

2017-03-09 [接受日期] 2017-04-05

國家自然科學基金(81370003, 81570223, 81000043). Supported by National Natural Science Foundation of China(81370003, 81570223, 81000043).

Yerkintay Guliya, 碩士生. E-mail：guliya_yer@126.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990， E-mail:zheyonghuang@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170195

R 445.2

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