重離子7Li輻射對玉米還原糖含量的影響研究

胡金山，耿金鵬，曹天光，安海龍，展永

（1.河北工業(yè)大學(xué)生物物理研究所，天津300401；2.華北理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北唐山063009）

重離子7Li輻射對玉米還原糖含量的影響研究

胡金山1，2，耿金鵬1，曹天光1，安海龍1，展永1

（1.河北工業(yè)大學(xué)生物物理研究所，天津300401；2.華北理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北唐山063009）

研究重離子7Li輻射對“永19”玉米自交系還原糖含量的影響.采用溴化鉀壓片法紅外光譜定性表征玉米還原糖.優(yōu)化3，5-二硝基水楊酸（DNS）法的最佳波長，在540 nm定量測定不同劑量重離子7Li輻射自交系的還原糖含量.提取液與標(biāo)準(zhǔn)品特征峰重合證明提取液為還原糖.定量結(jié)果表明10 Gy輻射還原糖含量高達(dá)4.50%，20和40 Gy輻射分別為3.94%、3.79%，而30和50 Gy輻射略低于對照（3.55%）.重離子7Li輻射對玉米還原糖含量有正負(fù)雙重作用呈現(xiàn)出馬鞍形曲線.

重離子7Li；輻射；還原糖；紅外表征；3，5-二硝基水楊酸

0 引言

重離子輻射誘變是指利用加速器產(chǎn)生高能離子束轟擊生物樣品從而誘發(fā)突變，具有遺傳穩(wěn)定周期短、突變率高、突變頻譜寬、生理損傷小等優(yōu)點(diǎn)[1-2].重離子束在與生物介質(zhì)作用時，將自身所攜帶大量能量沉積在其徑跡上，具有明顯的傳能線密度高的特點(diǎn)，特別是在其布拉格峰處，表現(xiàn)出局部相對突出的生物學(xué)效應(yīng)[3-5].不同于分子育種技術(shù)，重離子輻射誘變玉米育種并沒有外源基因的導(dǎo)入，只是其自身DNA發(fā)生了突變或遺傳重組[6].重離子輻射誘變結(jié)合常規(guī)育種方法選育性狀變異明顯，營養(yǎng)價值豐富，品質(zhì)優(yōu)良，適應(yīng)不同生態(tài)區(qū)域種植的優(yōu)良品種，對于創(chuàng)新玉米種質(zhì)資源，培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良玉米品種，保障我國的糧食安全、食品安全都具有十分重要的意義.

經(jīng)過7年13代在河北永年和海南陵水試驗(yàn)基地的加代培育，重離子7Li輻射誘變的“永19”玉米自交系表觀性狀已經(jīng)穩(wěn)定遺傳.不同劑量7Li輻射處理出現(xiàn)明顯的表觀性狀變異，比如出現(xiàn)高產(chǎn)、抗逆性增加、花藥變色、早熟等優(yōu)良性狀[7].眾所周知，作為重要的糧食作物，玉米的營養(yǎng)價值高低在新品種選育過程中起到至關(guān)重要的作用.已有證據(jù)表明12C輻射能夠部分改善玉米蛋白和脂肪酸含量[8-9]，但重離子7Li輻射誘變玉米的營養(yǎng)組成和含量是否發(fā)生變化目前仍不清楚，國內(nèi)外均未見相關(guān)報道.玉米還原糖營養(yǎng)價值豐富易于消化吸收，其含量變化是玉米營養(yǎng)品質(zhì)的重要評價指標(biāo)之一.目前還原糖大多采用DNS比色法測定，該方法受客觀因素影響較小，具有可重復(fù)性強(qiáng)、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)適于批量測定[10].

本研究采用紅外表征配合DNS法對不同劑量重離子7Li輻射誘變玉米自交系的還原糖進(jìn)行定性定量測定，揭示不同劑量7Li輻射對還原糖含量的影響規(guī)律，為重離子輻射誘變玉米育種理論的發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：“永19”玉米自交系種子由河北省永年農(nóng)作物研究所提供，重離子輻射誘變實(shí)驗(yàn)2008年在中國原子能科學(xué)院HI-13串列加速器上完成，輻射劑量分別為0 Gy（CK），10 Gy，20 Gy，30 Gy，40 Gy和50 Gy，具體物理參數(shù)詳見表1.通過在河北永年和海南陵水加代培育，按輻射劑量將不同單株混合傳代選育優(yōu)良性狀，第1-3代變異明顯，第4代后表觀性狀基本趨于穩(wěn)定.還原糖分析所用玉米（圖1）為2015年海南陵水基地培育的不同劑量7Li輻射處理后的第13代，CK同為第13代未輻射樣品.

表1 HI-13加速器輻射處理物理參數(shù)Tab.1 Physical parameters of HI-13 accelerator radiation

圖1 不同劑量重離子7Li輻射誘變的“永19”玉米自交系Fig.1 Different radiation doses of heavy ion7Li to“Yong 19”maize inbred line

試劑：鹽酸、氫氧化鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、碘、碘化鉀等均為分析純；3，5-二硝基水楊酸、無水葡萄糖、溴化鉀為光譜純.

1.2 儀器與設(shè)備

美國NICOLET AVATAR 360傅立葉紅外光譜儀；上海精科UV 765紫外可見分光光度計(jì)；德國SIGMA3-30K臺式高速離心機(jī)；瑞士METTLER TOLEDO MX5超精密電子天平；國華電器HH-8數(shù)顯恒溫水浴；上海一恒DHG-9075鼓風(fēng)干燥箱；上海陽光766-3遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱；固特超聲波清洗機(jī)KQ-500DE.

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

1）3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：分別稱取6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L NaOH溶液，加入500 mL含有182.0 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加入5.0 g苯酚和5.0 g無水亞硫酸鈉攪拌至溶解，冷卻加水定容到1 000 mL，棕色試劑瓶避光保存，放置一周后使用.

2）1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：將無水葡萄糖置于鼓風(fēng)干燥箱98℃干燥直至恒重，準(zhǔn)確稱取1.000 0 g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容到1 000 mL搖勻備用.

3）玉米還原糖提取液：將玉米自交系籽粒粉碎過0.25 mm篩，準(zhǔn)確稱取5.0 g玉米粉末加入50 ml蒸餾水，50℃、100 W超聲輔助提取20 min，至還原糖溶解析出，25 000×g/min離心30 min，棄沉淀取上清液定容到100 mL.

1.3.2 紅外光譜表征

首先將還原糖溶液在遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱中干燥成粉末.還原糖或葡萄糖分別與KBr按質(zhì)量比1∶100在瑪瑙研缽中均勻研磨.采用溴化鉀壓片法進(jìn)行紅外光譜表征，壓片機(jī)壓力20 MPa，作用時間1 min，壓制出透明壓片，采集待測樣品的紅外光譜，掃描累加5次，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1.

1.3.3 DNS試劑最佳吸收波長的確定

取0.5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL小試管中，加入1.5 mL的DNS試液，搖勻糖溶液，放入沸水浴中反應(yīng)5 min，快速冷卻至室溫，加入蒸餾水定容到25 mL.紫外可見分光光度計(jì)分別掃描DNS試劑-水（空白）、葡萄糖顯色液-水（空白）、葡萄糖顯色液-DNS（空白）在470～600 nm范圍內(nèi)的吸收光譜.

1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按表2進(jìn)行配置操作，充分混勻后沸水浴中加熱5 min，快速冷卻至室溫，再分別向各試管中加入蒸餾水混勻定容到25 mL.以管1號為空白對照，在最佳波長條件下分別測定各管的吸光度.以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度-葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.5 玉米自交系還原糖含量的測定

準(zhǔn)確移取0.5 mL還原糖提取液于10 mL小試管中，加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴中反應(yīng)5 min，快速冷卻至室溫，蒸餾水定容到25 mL，以相同條件下不加還原糖提取液作為空白，在最佳波長條件下測定反應(yīng)液的吸光度.還原糖提取和含量測定按不同輻射劑量隨機(jī)選取5株玉米分5次單獨(dú)進(jìn)行，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出還原糖溶液濃度，計(jì)算出玉米還原糖的百分含量及標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）.

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制Tab.2 Configure the glucose standard solution

圖2 傅立葉紅外光譜表征Fig.2 Fourier infrared spectrum characterization

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜表征

圖2所示為紅外光譜表征，圖中兩條曲線分別為玉米還原糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的傅立葉紅外光譜.特征峰3 500～3 200 cm-1處為O-H的伸縮振動，提示有羥基存在；2 900 cm-1附近小尖峰為醛基C-H的特征峰；2 400～2 300 cm-1左右為羰基峰；1 700～1 600 cm-1附近為C-C特征峰，1 400 cm-1附近為C-H的面內(nèi)彎曲震動；1 200～1 000 cm-1處為C-O的伸縮振動是糖醇的特征峰，550 cm-1左右為4個碳原子以上的亞甲基聯(lián)動[7].由圖2可知，還原糖與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品主要特征峰基本重合，證明提取物質(zhì)為還原糖.玉米還原糖與葡萄糖的峰形相似，峰高和峰面積不同，表明兩者糖含量接近，但組分可能略有不同[11].

2.2 最佳吸收波長的確定

DNS試劑在中性或偏堿性條件下與還原糖共熱反應(yīng)，還原生成棕紅色氨基化合物3-氨基-5-硝基水楊酸，反應(yīng)溶液的顏色和還原糖的含量在一定范圍內(nèi)呈正比[12].文獻(xiàn)中關(guān)于DNS法測定還原糖的最佳波長有520、540和580 nm[13-14]等多種報道，各不相同相差較大.圖3所示為470～600 nm掃描結(jié)果，最大吸收處的波長為470 nm，盡管選取最大吸收波長測定可以提高靈敏度，但在此波長下DNS試劑（DNS-水曲線）也有較強(qiáng)吸光嚴(yán)重干擾測定，結(jié)合葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液-水曲線可以看出，這種影響在波長小于530 nm的情況下一直比較明顯.綜合圖3中3條曲線，在波長540 nm處顯色劑和還原糖的影響相對最小，因此實(shí)驗(yàn)中選取540 nm為最佳測定波長.

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度葡萄糖顯色液在540 nm可見光下吸光度不同，吸光度與葡萄糖濃度基本成正比.圖4所示為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.20～0.80 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖與DNS試劑反應(yīng)穩(wěn)定、顯色靈敏，葡萄糖濃度與對應(yīng)的吸光度之間線性關(guān)系良好.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線輕微偏離原點(diǎn)可能是由于配制DNS試劑過程中加入的酒石酸鉀鈉所致，盡管酒石酸鉀鈉的作用是防止溶解氧的侵入，促進(jìn)顯色穩(wěn)定同時提高反應(yīng)的顯色靈敏度，但卻減弱了亞硫酸鈉對還原糖的保護(hù)作用，從而造成微量葡萄糖的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞而不顯色[10].因此，在還原糖濃度較低的情況下對測定有輕微影響，造成實(shí)測結(jié)果相對偏低.

2.4 重離子7Li輻射劑量對玉米自交系還原糖含量的影響

按上述方法，分別對10 Gy、20 Gy、30 Gy、40 Gy和50 Gy 5種不同劑量重離子7Li輻射誘變的玉米自交系以及對照（CK）樣品的還原糖進(jìn)行測定.還原糖含量的定量結(jié)果詳見圖5，10 Gy輻射誘變玉米自交系的還原糖含量高達(dá)4.50%，20 Gy和40 Gy輻射分別為3.94%和3.79%，而30 Gy和50 Gy輻射分別為3.39%和3.28%略低于對照樣品（3.55%）.與對照相比，不同劑量處理組差異顯著（P＜0.05）.當(dāng)輻射劑量達(dá)到60 Gy或更大時，由于玉米田間出苗率急劇下降且超過半數(shù)致死，因此沒有進(jìn)一步跟蹤統(tǒng)計(jì).顯而易見，重離子7Li輻射誘變能夠部分改善玉米自交系還原糖的含量，對玉米自交系的還原糖含量有正負(fù)雙重效應(yīng)，呈現(xiàn)出類馬鞍形的“M”曲線.

圖3 波長掃描Fig.3 Wavelength scan

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The glucose standard curve

圖5 重離子7Li輻射劑量對還原糖含量的影響Fig.5 Effects of heavy ion7Li radiation doses on reducing sugar content

吳躍進(jìn)[15]早期研究N離子注入水稻的生物效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)低能重離子的劑量-存活率曲線呈馬鞍型.之后眾多研究表明細(xì)菌、植物細(xì)胞及種子中均存在因重離子輻射而產(chǎn)生的馬鞍形劑量-存活率效應(yīng)[16-17]，該現(xiàn)象引起了科研人員的廣泛關(guān)注.耿金鵬報道了不同劑量重離子7Li輻射對“永19”玉米株高、穗位高也有馬鞍形效應(yīng)出現(xiàn)[7].邵春林綜合能量、質(zhì)量沉積和電荷協(xié)同效應(yīng)提出了EMC模型從理論角度闡述馬鞍形產(chǎn)生的機(jī)理[18].盡管該理論模型與部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合較好，但依然缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來揭示機(jī)理.結(jié)合重離子7Li輻射對還原糖含量的影響，我們推測重離子輻射首先引起DNA的損傷修復(fù)并最終影響還原糖含量積累，馬鞍形劑量效應(yīng)可能是一種普遍的輻射誘變效應(yīng).

目前，關(guān)于重離子7Li輻射誘變究竟如何影響玉米自交系的蛋白、氨基酸、脂肪酸等其它營養(yǎng)成分仍不清楚，尚有待于進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，進(jìn)而從營養(yǎng)學(xué)角度生物大分子水平為重離子輻射玉米種質(zhì)資源創(chuàng)新提供依據(jù).

3 結(jié)論

1）紅外光譜表征可以作為鑒定玉米還原糖的一種佐證手段，應(yīng)用DNS法可以在540 nm對玉米還原糖進(jìn)行快速定量分析.

2）10 Gy重離子7Li輻射能夠顯著提高玉米自交系還原糖含量.

3）重離子7Li輻射對還原糖含量有正負(fù)雙重效應(yīng)，還原糖含量隨輻射劑量出現(xiàn)類馬鞍形的“M”曲線.

致謝：承蒙中國原子能科學(xué)院北京串列加速器核物理國家實(shí)驗(yàn)室和河北省永年農(nóng)作物研究所的鼎力相助，特此感謝!

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[責(zé)任編輯 代俊秋]

Effects of heavy ion7Li irradiation on maize reducing sugar content

HU Jinshan1，2，GENG Jinpeng1，CAO Tianguang1，AN Hailong1，ZHAN Yong1

（1.Institute of Biophysics,Hebei University of Technology,Tianjin 300401,China;2.College of Chemical Engineering,North China University of Science and Technology,Hebei Tangshan 063009,China）

An investigation demonstrated the effects of heavy ion7Li irradiation on“Yong 19”maize inbred lines'reducing sugar content.Using KBr tableting technique,maize reducing sugar was qualitatively characterized by infrared spectrum.Then,optimized the wavelength for 3,5-dinitro salicylic acid(DNS）determination,all the reducing sugars from different doses of heavy ion7Li treated inbred lines were quantitatively measured at 540 nm.These characteristic peaks of extraction and standard were coincident,which proved that the extraction was reducing sugar.The quantitative results showed that reducing sugar content of 10 Gy radiation reached as high as 4.50%,20 and 40 Gy radiation were 3.94%and 3.79%,whereas 30 and 50 Gy radiation were slightly lower than that of the control sample(3.55%).It indicated that heavy ion7Li irradiation has both positive and negative effects on maize reducing sugar content,which presented a kind of saddle-type curve.

heavy ion7Li;irradiation;reducing sugar;infrared characterization;3,5-dinitro salicylic acid

Q691

A

1007-2373（2017）03-0008-05

10.14081/j.cnki.hgdxb.2017.03.002

2016-12-15

河北省自然科學(xué)基金（B2014209314，C2013202192）；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（ZD2017023）；唐山市科技計(jì)劃（13130225z）

胡金山（1979-），男，副教授，博士研究生.通訊作者：展永（1954-），男，教授，博士生導(dǎo)師.