帶葉兜蘭種子無(wú)菌萌發(fā)及試管成苗技術(shù)研究

田凡++顏鳳霞++姜運(yùn)力++王蓮輝

摘要：為初步建立帶葉兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖體系，對(duì)帶葉兜蘭（Paphiopedilum hirsutissimum）成熟種子進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)、原球莖分化及根誘導(dǎo)研究。結(jié)果表明：有機(jī)添加物香蕉對(duì)原球莖的誘導(dǎo)與分化有較好的促進(jìn)作用；培養(yǎng)基配比為：1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭，對(duì)原球莖的誘導(dǎo)和增殖有明顯的促進(jìn)作用；不同濃度配比的6-BA和NAA對(duì)芽增殖影響不明顯，但低濃度的NAA對(duì)芽的分化影響顯著；1/2 MS+IBA 0.2 mg/L對(duì)帶葉兜蘭的根誘導(dǎo)效果最為理想；碎樹(shù)皮為栽培基質(zhì)的移栽成活率達(dá)96%。

關(guān)鍵詞：帶葉兜蘭；無(wú)菌萌發(fā)；快繁；試管成苗；培養(yǎng)基

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.310.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0030-04

兜蘭屬（Paphiopedilum）隸屬于蘭科（Orchidaceae）植物，主要分布于我國(guó)貴州、廣西和云南[1]。兜蘭具有很高的觀(guān)賞價(jià)值，十分珍貴，野生資源遭到過(guò)度采掘，已經(jīng)到了瀕臨滅絕的邊緣，被列入《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》的保護(hù)對(duì)象[2]。兜蘭種子沒(méi)有胚乳，在自然環(huán)境中須與真菌共生才能萌發(fā)，且萌發(fā)率極低[3]。而兜蘭的克隆增殖是世界性難題，即使能誘導(dǎo)出愈傷組織或幼芽，增殖率仍很低[4]。目前，利用種子非共生無(wú)菌萌發(fā)成苗是兜蘭植物規(guī)模化快繁的唯一途徑，是解決其保育問(wèn)題的重要手段。

帶葉兜蘭（Paphiopedilum hirsutissimum）是兜蘭屬地生或半附生草本植物，是蘭科中最原始的類(lèi)群之一，株形娟秀，花朵造型獨(dú)特，花期持久，被譽(yù)為兜蘭中的“美嬌娘”[5]。目前，關(guān)于兜蘭屬其他植物的種質(zhì)保護(hù)與無(wú)菌苗快繁技術(shù)已有很多報(bào)道[6-10]，但與帶葉兜蘭相關(guān)的研究鮮有報(bào)道[11-12]。研究了帶葉兜蘭種子無(wú)菌播種與試管快速成苗體系，探討帶葉兜蘭組培快繁技術(shù)，以期為帶葉兜蘭人工快繁的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持，為最終實(shí)現(xiàn)帶葉兜蘭種質(zhì)資源的保育及可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

帶葉兜蘭（Paphiopedilum hirsutissimum）植株為貴州省林業(yè)科學(xué)研究院種質(zhì)資源。5月盛花期進(jìn)行人工同種異株授粉（圖1）；當(dāng)年9月左右，種子干燥接近成熟，從授粉到蒴果成熟開(kāi)裂需要120 d左右（圖2）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子預(yù)處理先將帶葉兜蘭種子莢流水沖洗5 h后移入超凈工作臺(tái)，用75%乙醇浸泡10 min，0.1%次氯酸鈉浸泡15 min，后用無(wú)菌水沖洗3～5次。用無(wú)菌濾紙吸干多余水分，切開(kāi)種皮，將種子撒落在所配制的各種固體瓊脂培養(yǎng)基上。

1.2.2培養(yǎng)基

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中加葡萄糖30 g/L（生根為20 g/L）和瓊脂6 g/L作為固定劑，加熱完全融化后調(diào)至pH值5.2～5.4，分別裝40 mL到培養(yǎng)瓶中，用瓶蓋封口，每一個(gè)處理接種15～20瓶，放在蒸汽高壓鍋（120 ℃，20 min）內(nèi)滅菌，室溫冷卻后待用。

1.2.2.1不同有機(jī)添加物對(duì)原球莖誘導(dǎo)與分化的影響

將種子分別接種到5種培養(yǎng)基：（M1）1/2MS+10%馬鈴薯+20%葡萄糖+0.4%瓊脂+0.1%活性炭；（M2）1/2MS+10%椰乳+2.0%葡萄糖+0.4%瓊脂+0.05%活性炭；（M3）1/2MS+10%香蕉+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（M4）1/2MS+10%蘋(píng)果汁+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（M5） 1/2MS+15%椰乳+2.0%葡萄糖+04%瓊脂。

1.2.2.2不同濃度6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，簡(jiǎn)稱(chēng)6-BA）和萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)NAA）對(duì)芽增殖分化的影響

前期試驗(yàn)分別對(duì)6-BA、NAA進(jìn)行激素組合及配比試驗(yàn)，篩選增殖分化有效培養(yǎng)基配方：（N1） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（N2） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+005%活性炭；（N3） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（N4） 1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+0.1 mg/L NAA+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+[JP3]0.05%活性炭；（N5） 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+20%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭。

1.2.2.3不同濃度6-BA、NAA及有機(jī)添加物對(duì)芽增殖分化的影響

（L1） 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L2） 1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L3）1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L4） 1/2MS+NAA 0.1 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（L5）1/2MS+NAA 0.1 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L6） 1/2MS+NAA 001 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+5%椰乳。

1.2.2.4生根培養(yǎng)基

設(shè)置3種不同激素的生根培養(yǎng)基：（B1）1/2MS+吲哚丁酸（indole-3-butytric acid，簡(jiǎn)稱(chēng)IBA）0.2 mg/L；（B2）1/2MS+NAA 0.2 mg/L；（B3）1/2MS+IAA 0.4 mg/L。將分化出具有2～3張葉、高1.5 cm左右的小苗從培養(yǎng)瓶中取出轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基B1～B3上。

1.2.3培養(yǎng)條件

1.2.3.1種子萌發(fā)、原球莖誘導(dǎo)及增殖評(píng)價(jià)方法

培養(yǎng)室溫度維持在23～25 ℃之間。接種后先暗培養(yǎng)3周，觀(guān)察種子吸脹膨大，有白色原球體長(zhǎng)出，每個(gè)處理隨機(jī)調(diào)查50粒種子。萌發(fā)后置于光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，12 h/d。待種子萌發(fā)后，觀(guān)察原球莖轉(zhuǎn)綠，有葉原基出現(xiàn)，以白色的原球莖膨大到轉(zhuǎn)綠色小芽的多少統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率（圖3、圖4）。種子在培養(yǎng)基上培養(yǎng)3個(gè)月后，調(diào)查萌發(fā)數(shù)（由于種子極其細(xì)小且數(shù)量很大，很難記數(shù)，因播種方法一致，每瓶播種的種子數(shù)量可視為一致，所以本研究只統(tǒng)計(jì)每瓶萌發(fā)的種子數(shù)量）。根狀莖切段在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后調(diào)查增殖情況。每種處理調(diào)查50個(gè)外植體，對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.4煉苗與移栽

將瓶苗從培養(yǎng)室（恒溫室）移至與外界相通的室內(nèi)放置1 d后，去瓶蓋煉苗3～7 d（培養(yǎng)基有輕微污染）后，洗凈瓶苗根部的培養(yǎng)基，用稀釋1 000倍的甲基硫菌靈或多菌靈浸泡組培苗根部，放置于通風(fēng)陰涼處晾干水分至根系發(fā)白變軟，即可用于移栽。選擇碎樹(shù)皮、泥炭土、田園土3種基質(zhì)為瓶苗栽培基質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1有機(jī)添加物對(duì)帶葉兜蘭原球莖誘導(dǎo)與分化的影響

在蘭科植物的無(wú)菌播種過(guò)程中，添加適量的不同有機(jī)添加物，通常會(huì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)與發(fā)育。試驗(yàn)選用馬鈴薯、椰乳、香蕉、蘋(píng)果汁對(duì)帶葉兜蘭原球莖進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。由圖5可知，在培養(yǎng)基中添加香蕉對(duì)帶葉兜蘭的種子萌發(fā)均具有顯著的促進(jìn)作用，種子萌發(fā)率達(dá)95%，且均變綠；由圖6可知，添加馬鈴薯和香蕉的培養(yǎng)基中，原球莖的褐化率都較低，彼此間沒(méi)有顯著差別；由圖7可知，在添加了香蕉的培養(yǎng)基中，兜蘭原球莖分化率略大于其他3種添加物?？梢?jiàn)， 香蕉對(duì)帶葉兜蘭原球莖誘導(dǎo)與分化具有促進(jìn)作用，生長(zhǎng)狀況最好。

2.2植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芽增殖分化的作用

由圖8可知，不同濃度配比的6-BA和NAA對(duì)帶葉兜蘭芽的增殖率影響差異不顯著，增殖率均在40%～48%；但是，不同濃度培養(yǎng)基對(duì)芽分化率的影響差異顯著。由圖9可知，N4培養(yǎng)基在5個(gè)培養(yǎng)基激素配比對(duì)比組中，具有顯著促進(jìn)分化作用。結(jié)果表明，5個(gè)不同濃度配比的培養(yǎng)基均具有增殖作用，但是增殖效果不明顯，不具有差異性，但是以 6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L為濃度的培養(yǎng)基（N4）對(duì)分化具有明顯促進(jìn)作用，分化率達(dá)48%，而N2培養(yǎng)基的芽分化率只有5%，說(shuō)明高濃度的6-BA和低濃度的NAA利于其分化。為了更好地促進(jìn)芽的增殖與分化，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同有機(jī)添加物和6-BA及NAA濃度對(duì)芽褐化與分化的影響的處理（圖10、圖11）。由圖10可知，N5和N6培養(yǎng)基的褐化率最低，只有27%，處理中NAA濃度分別為0.1、0.01 mg/L，都是低濃度，說(shuō)明低濃度的NAA利于芽的分化。

2.3植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)壯苗生根培養(yǎng)的影響

本試驗(yàn)將分化出具有3～4張葉、高2 cm左右的小苗從培養(yǎng)瓶中取出，分別轉(zhuǎn)入不同激素及濃度配比的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)。結(jié)果表明，誘導(dǎo)生根率達(dá)89%及其以上，但生根數(shù)量、生長(zhǎng)長(zhǎng)度及長(zhǎng)勢(shì)之間有一定的差異。從表1可知，培養(yǎng)基B2的生根率最高，達(dá)到95%，但植株根系長(zhǎng)勢(shì)弱，部分葉片偏黃；培養(yǎng)基B3中根系較細(xì)；培養(yǎng)基B1植株生長(zhǎng)健壯，根系健壯，12周后長(zhǎng)成 3～4條肉質(zhì)根。所以，IBA所用濃度為0.2 mg/L作為生根誘導(dǎo)壯苗培養(yǎng)基最好。

2.4不同栽培基質(zhì)對(duì)帶葉兜蘭成活率的影響

栽培時(shí)先將栽培基質(zhì)和腐殖土混合放入栽培容器內(nèi)，深度達(dá)容器的1/3高，將長(zhǎng)出4～5張葉片、根長(zhǎng)2 cm以上并具有3～4條根的兜蘭幼苗放入栽培容器內(nèi)，用碎樹(shù)皮及苔蘚將苗的根頸部以下填實(shí)，讓容器和栽培基質(zhì)緊密接觸。帶葉兜蘭根系最忌通氣不良和積水，盆栽和苗床上種植時(shí)，床下部須墊一層顆粒狀的小石塊，以利排水。每2～3周追施1次液體肥料，秋末氣溫降低后停止施肥。從表2可知，植株在田園土的適應(yīng)過(guò)程較慢，碎樹(shù)皮栽培基質(zhì)的移栽成活率最高，達(dá)97%，最適合帶葉兜蘭試管苗的生長(zhǎng)（圖4）。

3結(jié)論與討論

兜蘭是蘭科植物中極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的重點(diǎn)保護(hù)種群之一[13]，以往的研究表明，帶葉兜蘭是萌發(fā)較為困難的種類(lèi)之一，通過(guò)綜合各試驗(yàn)階段，快速獲得大量帶葉兜蘭無(wú)菌試管苗，初步建立一套完整的帶葉兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖體系，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用帶葉兜蘭奠定基礎(chǔ)。

培養(yǎng)基的鹽分組成和濃度是影響兜蘭種子萌發(fā)的重要因素[14]，已報(bào)道的大部分兜蘭種類(lèi)在高鹽濃度MS培養(yǎng)基上萌發(fā)均受到抑制，而在1/2、1/4的MS培養(yǎng)基上較為適宜。由于兜蘭種類(lèi)的不同最終選用的培養(yǎng)基類(lèi)型也就不同，本試驗(yàn)中帶葉兜蘭在1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)最佳，此結(jié)果和其他兜蘭屬植物相吻合。但在播種過(guò)程中，要注意種子的成熟度、無(wú)菌播種等因素，以免造成種子發(fā)芽率低。培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)物椰乳、香蕉、馬鈴薯和活性炭等均有利于蘭科植物種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。一般認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入適量的椰乳對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用[15]，添加馬鈴薯對(duì)兜蘭種子萌發(fā)也有較明顯的促進(jìn)作用，且原球莖的顏色呈濃綠色，而香蕉泥對(duì)兜蘭種子的萌發(fā)反而有抑制作用[16]。

本試驗(yàn)以成熟種子為外植體，研究以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同激素配比和有機(jī)物對(duì)帶葉兜蘭的種子萌發(fā)、原球莖及芽增殖、分化和生根誘導(dǎo)的影響，從中篩選出適合各個(gè)培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明：添加有機(jī)物香蕉的培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用；在原球莖繼代增殖階段，NAA和 6-BA組合對(duì)原球莖繼代增殖的作用顯著，通過(guò)NAA及6-BA濃度配比試驗(yàn)，以6-BA與NAA濃度比為10 ∶1時(shí)效果最佳，即原球莖繼代增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+005%活性炭；在芽增殖及分化階段，不同濃度配比的6-BA和NAA對(duì)芽增殖影響不明顯，但低濃度的NAA對(duì)芽的分化影響顯著；在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基階段，以1/2MS為主的基本培養(yǎng)基，IBA濃度為0.2 mg/L時(shí)生根效果最好，植株生長(zhǎng)健壯，說(shuō)明低濃度的IBA有利于根的生長(zhǎng)。這與前期試驗(yàn)中白花兜蘭種子無(wú)菌萌發(fā)及試管成苗研究中的生根誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果一致[17]。在不同栽培基質(zhì)對(duì)帶葉兜蘭移栽成活率的影響試驗(yàn)中，碎樹(shù)皮的移栽成活率達(dá)97%，生根整齊，長(zhǎng)勢(shì)良好。

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