基于微孔板對(duì)野生櫻桃李果皮色素提取工藝的研究

張相鋒　焦子偉　楊曉絨

摘要：通過(guò)傳統(tǒng)的固液萃取法，以微孔板分光光度技術(shù)結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)野生櫻桃李果皮色素提取進(jìn)行了研究，確定了野生櫻桃李果皮色素的吸光特性在512nm處。發(fā)現(xiàn)考察因素對(duì)色素提取效果影響的順序?yàn)椋毫弦罕?乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間，最優(yōu)提取條件為乙醇濃度50%，提取時(shí)間1h，料液比1：15，提取溫度為55℃。但是這一最優(yōu)組合在正交試驗(yàn)組中沒(méi)有出現(xiàn)，因此我們可以在后續(xù)試驗(yàn)中以料液比、乙醇濃度、提取溫度為主要考察因素，以正交試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)工藝為參數(shù)，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，以便進(jìn)一步提高提取工藝的高效性。

關(guān)鍵詞：固液萃取法；微孔板；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；野生櫻桃李果皮；色素

多酚是一種對(duì)人類健康非常有益的植物次生代謝物。植物體內(nèi)有很多種多酚，比如在花卉、水果、蔬菜中以各種艷麗的顏色出現(xiàn)的天然色素類物質(zhì)花青素?；ㄇ嗨厥强寡趸瘎?，具有很強(qiáng)的清除自由基能力，通過(guò)提供質(zhì)子，減弱高活性的自由基的氧化性。同時(shí)，花青素類物質(zhì)還具有抗菌、抗病毒、抗感染等活性。長(zhǎng)期攝入富含花青素的食物可以降低患癌癥、心血管疾病、病毒感染、老年癡呆癥和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)同。還有試驗(yàn)證明，花青素還可以改善夜視能力。它們作為天然色素添加劑，廣泛應(yīng)用于食品和飲料行業(yè)，另外在化妝品和油漆行業(yè)也有應(yīng)用。

隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)食品安全關(guān)注度越來(lái)越高。許多國(guó)家開(kāi)始逐步禁止合成色素類食品添加劑的使用，取而代之的是安全無(wú)毒的天然色素。我國(guó)天然色素產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，天然色素總產(chǎn)量已達(dá)10余萬(wàn)t，最具代表性的有焦糖色素（即糖色）、梔子黃、梔子藍(lán)、姜黃、莧菜紅、辣椒紅、茶色素。

野生櫻桃李（Prunusdivaricata Ldh）為重要的野生果樹(shù)資源，在我國(guó)僅分布于新疆伊犁霍城縣，已列為國(guó)家重點(diǎn)二級(jí)保護(hù)植物。從果實(shí)顏色來(lái)看，自然條件下分布的野生櫻桃李的果實(shí)有紅色、棕紅色、紫黑色和黃色果等類型。

我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，野生櫻桃李果色主要由其果皮顏色決定，其中紫黑色果實(shí)果皮色素含量最高。新疆當(dāng)?shù)毓_克族牧民自制野生櫻桃李果醬顏色亮麗，而且長(zhǎng)期儲(chǔ)藏不退色，因此我們以野生櫻桃李紫黑色果實(shí)的果皮為材料，對(duì)其色素提取工藝進(jìn)行了深入的研究，以便為今后開(kāi)發(fā)新的天然色素資源奠定理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1材料與試劑

野生櫻桃李紫黑果采于新疆伊犁州霍城縣大西溝；乙醇為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀：Thermo scientific Mutiscan GO；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；SHZ-D9（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；800型離心機(jī)：上海磁極器材廠；96孔酶標(biāo)板：康寧。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1確定野生櫻桃李果皮色素的最大吸收波長(zhǎng)。準(zhǔn)確稱取已備好的野生櫻桃李果皮樣品10.000g，用100mL的50%乙醇，提取溫度為50%，回流時(shí)間為1h，抽濾，離心，用pH值1.0的KCl緩沖液以1：10對(duì)色素原液進(jìn)行稀釋。取稀釋好的色素提取液150ul，加入96孔酶標(biāo)板，在酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)為400～760nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以50%的乙醇為空白對(duì)照，進(jìn)行光譜掃描，篩選出野生櫻桃李果皮色素提取液的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2提取方法。準(zhǔn)確稱取10.000g野生櫻桃李果皮樣品，經(jīng)回流、抽濾、離心、稀釋，根據(jù)試驗(yàn)1.3.1測(cè)得的吸光特性，用最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定不同濾液的吸光度。

1.3.3單因素試驗(yàn)。以乙醇濃度、料液比、溫度、提取時(shí)間作為影響野生櫻桃李果皮色素提取效果的因素，以色素提取液的吸光度作為野生櫻桃李果皮色素提取效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。吸光度測(cè)量于96孔酶標(biāo)板，以相應(yīng)提取液作為空白對(duì)照，每孔上樣量為150ul，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度值，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

（1）乙醇濃度的選擇。準(zhǔn)確稱取10.000g野生櫻桃李果皮樣品5份，按料液比1：8取分別加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液混勻，置于60%條件的電熱恒溫水浴鍋中，回流浸提1h。用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。

（2）料液比的選擇。準(zhǔn)確稱取10.000g野生櫻桃李果皮樣品5份，再分別按料液比（1：10、1：12、1：14、1：16、1：18）加入50%的乙醇溶液混勻，再分別倒入相應(yīng)編號(hào)的回流瓶中，置于60%條件的電熱恒溫水浴鍋中，回流浸提1h。用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。

（3）提取溫度的選擇。準(zhǔn)確稱取10.000g野生櫻桃李果皮樣品5份，再分別按料液比1：10加入50%的乙醇溶液混勻，再分別倒入相應(yīng)編號(hào)的回流瓶中，再分別于30°C、40°C、50%、60°C、70°C條件的電熱恒溫水浴鍋中，回流浸提1h。用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。

（4）提取時(shí)間的選擇。準(zhǔn)確稱10.000g野生櫻桃李果皮樣品5份，再分別按料液比1：10加入50%的乙醇溶液混勻，再分別倒入相應(yīng)編號(hào)的回流瓶中，于50°C條件下的電熱恒溫水浴鍋中，分別回流浸提0.5h、1.0h、1.5h、2h。用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。

1.3.4正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)。在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合以上試驗(yàn)分析結(jié)果，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)影響因素為考察對(duì)象，以野生櫻桃李果皮色素提取液的吸光度值為參考值進(jìn)行正交試驗(yàn)，分析野生櫻桃李果皮色素提取的最優(yōu)提取方案，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平表如表1所示。

2.結(jié)果與分析

2.1野生櫻桃李果皮色素的吸光特性

由圖1可以看出，野生櫻桃李果皮色素在pH值1.0的KCl緩沖液中在可見(jiàn)光區(qū)512nm處有最大吸收峰，由此確定，野生櫻桃李果皮色素在pH值1.0條件下最大吸光特性為可見(jiàn)光512nm，由于溶液pH值對(duì)色素的吸光特性有很大影響，因此后續(xù)試驗(yàn)吸光度值測(cè)定均用pH值1.0的KCl緩沖液進(jìn)行稀釋，在512nm條件下進(jìn)行吸光度測(cè)量。endprint