分子生物學檢測技術在我國進出境植物檢疫中的應用及展望

金光耀 莊黎萍

摘要 綜述了目前國際植物檢疫上常用的實時熒光定量PCR技術、DNA條形碼技術的發(fā)展和技術特點，分析了這2種技術在進出境植物檢疫中的應用現(xiàn)狀、存在不足以及技術局限性，并對分子生物學檢測技術在我國進出境植物檢疫中的應用前景做了展望。

關鍵詞 植物檢疫；分子生物學技術； 應用； 展望

中圖分類號 S41-3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）02-0100-03

Abstract Development，technical features of realtime fluorescent quantitative PCR and DNA barcode in the entryexit plant quarantine inspection were reviewed.We analyzed the present situation of the application，shortcomings and limitations of those two technologies in entryexit plant quarantine of China.The application of molecular biological technique in entryexit plant quarantine of China were prospected.

Key words Plant quarantine；Molecular biology technology；Application；Prospect

隨著現(xiàn)代生物技術的不斷進步，特別是分子生物學檢測技術的發(fā)展，植物檢疫技術得到了極大提升，在病蟲害檢測方面尤為突出。隨著我國國際貿易不斷擴大，特別是加入WTO以來，大量外來有害生物隨貨物流入我國國境，我國進出境植物檢疫面臨著前所未有的巨大挑戰(zhàn)。有害生物檢測鑒定是植物檢疫執(zhí)法中一個重要的環(huán)節(jié)，形態(tài)學鑒定作為傳統(tǒng)植物檢疫檢測手段雖發(fā)揮著主導作用，但由于其自身存在諸多缺陷，越來越不適應當前我國進出境植物檢疫執(zhí)法對病蟲害快速、精準鑒定的需求。筆者就目前主流的實時熒光定量PCR技術、DNA條形碼技術在我國進出境植物檢疫中的應用及其對未來植物病蟲害檢測發(fā)展方向產生的影響進行了綜述和分析。

1 分子生物學檢測技術的發(fā)展

目前酶聯(lián)免疫吸附技術（EnzymeLinked Immunsorbent Assay， ELISA）已被廣泛應用于植物病毒、真菌、類菌質體等的檢測中[1-2]。隨著生物檢測技術的不斷發(fā)展，從免疫學技術到核酸技術，從核酸探針、RFLP技術到PCR技術，植物檢疫檢測技術正在不斷優(yōu)化，以適應科技進步發(fā)展的需要[3]。以PCR技術、DNA條形碼技術為代表的生物檢測技術已被廣泛應用于農業(yè)、醫(yī)學等領域。

1.1 實時熒光定量PCR技術

1985年美國Perkin-Elmer Cetus 公司人類遺傳研究室研究人員發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），使體外無限擴增核酸片段成為現(xiàn)實[4]。自PCR技術發(fā)明以來，該技術已被廣泛應用于醫(yī)學診斷、新型農業(yè)、檢驗檢疫、國防軍事、基因工程等領域。隨著PCR技術的不斷推新，傳統(tǒng)的PCR技術由于步驟繁瑣、耗時長、非特異性、致癌物質使用等原因，其應用受到很大限制。1992年提出來一種新型PCR技術——實時熒光定量PCR技術。1996年美國Applied Biosystems公司成功推出該技術[5]。與傳統(tǒng)PCR技術相比，它具有快速、靈敏、特異性強、自動化程度高、重復性好、定量準確等特點。隨著應用的推廣，該技術正在被各行業(yè)認可，特別是在檢驗檢疫系統(tǒng)中，實時熒光定量PCR技術已經被廣泛用于檢測植物病害、蟲害，不僅有效遏制了外來有害生物的入侵，而且在破除對外貿易技術壁壘、解決國際貿易糾紛上發(fā)揮了重要作用。

1.2 DNA條形碼技術

DNA條形碼技術是通過對一段標準化基因DNA序列的分析來實現(xiàn)對生物物種準確、快速鑒定的技術。該技術自2003年誕生以來，備受科學界關注，特別是在生物分類學領域已被廣泛采用，并改變了生物分類學的發(fā)展方向。Taulz等于2002年首先提出了DNA分類概念，即以DNA序列為基礎建立物種鑒定體系。隨后在2003年，Hebert等提出建立以線粒體細胞色素氧化酶亞基I（COI）基因5端648 bp的序列多樣性為基礎的條形碼鑒定系統(tǒng)，運用COI基因的序列多樣性對全球動物進行編碼，由此形成了成熟的DNA條形碼技術[4]。2004年，國際性合作組織生命條形碼聯(lián)盟建立，旨在開發(fā)出一套完整的條形碼標準流程和構建一個全面的條形碼數(shù)據(jù)庫。DNA條形碼技術很快在植物檢疫中得到應用，如應用DNA條形碼技術對新西蘭邊境截獲的毒蛾和果蠅標本進行重新分析，發(fā)現(xiàn)其與傳統(tǒng)PCR技術相比，具有靈活性、預測價值等優(yōu)勢[6]。國內學者魏書軍等[7]和張桂芬等[8]分別應用DNA條形碼技術對美洲棘薊馬（Echinothrips americanus Morgan）和西花薊馬（Frankliniella occidentalis Pergande）2種入侵性害蟲進行鑒定，均取得了很好的結果，充分展示了DNA條形碼技術在植物檢疫，特別是在外來有害生物物種鑒定方面廣闊的應用前景。

目前，DNA條形碼技術已在動物、植物、微生物物種鑒定方面得到了應用。雖然該技術具備眾多優(yōu)點，但由于生物物種的多樣性和物種基因間差異等因素，該技術仍有許多不足之處，如假基因的存在、線粒體基因遺傳的固有風險、COI進化速率的差異、種內差異和種間差異的重疊等因素都會對最終結果產生影響，從而造成誤判。另外，基因庫的建立是一個長期過程，同時還涉及基因庫數(shù)據(jù)共享的知識產權專利問題，因此，DNA條形碼技術尚處于開發(fā)階段，離大規(guī)模應用還有段距離。

2 我國進出境植物檢疫主要檢測技術特點及應用現(xiàn)狀

2.1 傳統(tǒng)植物檢疫檢測技術

我國進出境植物檢疫工作涉及植物及其產品或其他檢疫物的現(xiàn)場查驗、實驗室檢測、預防消毒與檢疫處理、疫情監(jiān)測與控制，其中實驗室檢測是植物檢疫過程中的重要環(huán)節(jié)，檢測結果的準確與否直接影響到植物檢疫人員的結果判定，其中病蟲草害鑒定是植物檢疫實驗室最主要的檢測項目。形態(tài)學鑒定、免疫學技術是有害生物傳統(tǒng)檢測方法。

形態(tài)學鑒定一直以來都是最常用的一種植物檢疫檢測技術，形態(tài)學鑒定方法雖然簡便、快速，但也存在以下缺陷：

①被用作鑒定的特征如果存在表型可塑性和遺傳可變性將會導致錯誤的鑒定結果。此類情況在進出境植物檢疫中經常遇到，截獲的昆蟲等有害生物由于生存環(huán)境、個體發(fā)育等原因使得個體間產生差異，例如在體色、體長以及其他局部細微特征（如復眼間距、2種特征長度間的數(shù)學關系等）上與鑒定資料描述有出入，導致鑒定人員無法做出正確的判斷。②形態(tài)學鑒定通常是針對生物某一特定發(fā)育階段或者性別才能識別。近年來，在進出境植物檢疫查驗中，截獲了大量外來有害生物樣本，但由于貨物種類、地理差異、運輸方式、除害處理等原因，多數(shù)只能截獲到昆蟲卵塊、幼蟲、蛹，甚至是殘體，利用形態(tài)學鑒定無法進行精確定種，只能分到大類，這樣就會造成在檢疫執(zhí)法中由于判斷依據(jù)不足而無法實施正確檢疫處理的后果，如果其中存在檢疫性有害生物，后果將不堪設想。③形態(tài)學鑒定方法忽略了許多類群中普遍存在的隱存分類單元，如昆蟲分類中對某些分類階元仍存在學術爭議。④形態(tài)學鑒定需要鑒定人員具備扎實的專業(yè)知識?！叭龣z合一”以來，我國進出境植物檢疫有了長足進步，人員隊伍不斷壯大，技術力量持續(xù)提升，但隨著業(yè)務量的快速增加、檢測難度的迅速提升、檢測方法的日益復雜、管理制度的規(guī)范完善，植物檢疫實驗室傳統(tǒng)的工作模式難以適應對植物檢疫檢測技術的更高需求，檢疫人員既要應對繁雜的業(yè)務查驗，又要耗費大量時間、精力從事以形態(tài)學鑒定為主的實驗室檢測工作，致使其難以專心從事、研究實驗室檢測工作[9]，這個已成為制約基層進出境植物檢疫實驗室發(fā)展的核心問題。

自20世紀70年代酶聯(lián)免疫吸附技術發(fā)明以來，免疫學技術作為一項新型分子生物學檢測技術已被廣泛應用于植物病害檢測中，之后相繼衍生出免疫熒光技術、斑點免疫技術、免疫電鏡技術等檢測方法。免疫學技術雖然為植物病害檢測提供了相對準確的檢測結果，但由于檢測周期長、工作量大、試劑盒成本高、抗干擾能力不強等不利因素較多，在植物檢疫檢測領域，免疫學技術正逐漸被PCR技術、DNA條形碼技術所代替。

2.2 實時熒光定量PCR技術

隨著我國外向型經濟的發(fā)展，“質量興國、科技興檢”戰(zhàn)略持續(xù)深入推進，基層植物檢疫實驗室有了長足發(fā)展，有害生物鑒定方法也有了較大改變，從傳統(tǒng)的單一形態(tài)學鑒定方法逐漸變成以形態(tài)學鑒定為主，血清學技術、PCR技術等其他新型物種檢測技術為輔的多元化結構方向發(fā)展，其中以實時熒光定量PCR技術為代表的新型有害生物鑒定方法，已經在部分植物檢疫實驗室得到應用，并取得了初步成果。2009年，為應對北美植物保護組織（NAPPO）正式通過的《來自亞洲舞毒蛾疫區(qū)船舶及貨物操作管理指南》（NAPPO植物衛(wèi)生措施區(qū)域標準第33號）對我國對外貿易的嚴重影響，我國檢驗檢疫科研人員運用分子標記技術進行了地理種群分析，最終證明北美種群與亞洲種群明顯分為2支，支持率達100%，成功化解了此次貿易壁壘。2010年，江蘇檢疫局植物檢疫實驗室運用 PCR 方法首次從加拿大輸華油菜籽中檢出十字花科小球腔菌（Leptosphaeriq maculans），并連續(xù)檢測出 5批次，病原菌的檢出率達80%。同年，江蘇檢驗檢疫局植物檢疫實驗室使用特異性引物擴增的方法，從美國進境紫花苜蓿干草中，檢疫出我國禁止進境的檢疫性真菌病害苜蓿黃萎病（Verticillium wilt）。可見， 實時熒光定量PCR技術是我國進出境植物檢疫中不可或缺的高端檢測技術。

雖然實時熒光定量PCR技術已趨成熟，但在植物檢疫領域的應用還不夠多，主要是由于：①地方經濟、口岸條件、植檢業(yè)務不一，許多口岸植物檢疫實驗室基礎差異較大，具備PCR檢測能力的實驗室較少；②傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定較為簡單便捷、易于上手，在植物檢疫檢測中仍是最常用的檢測方法；③相對繁瑣的PCR操作流程無法滿足大量的外來有害生物樣品檢測任務；④我國尚未建立外來有害生物基因庫，對該技術的推廣應用造成了一定影響。

2.3 DNA條形碼技術

DNA條形碼是利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA片段來進行物種鑒定的分子診斷新技術，是近年來生物分類和鑒定的研究熱點。該技術在鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱存種，重建物種和高級階元的系統(tǒng)演化關系等領域具有廣泛的應用前景。 近年來，DNA條形碼技術在我國植物檢驗檢疫中得到普遍應用，取得了不少成果。如昆蟲DNA條形碼試劑盒檢測技術針對我國出入境植物檢疫性及危險性昆蟲的主要類群，選擇合適的目標基因片段，設計通用引物，提高了擴增效率。將目標基因序列上的多態(tài)位點規(guī)律作為物種的鑒定特征（基因條碼特征），為檢疫性物種建立身份證，構建昆蟲基因條碼數(shù)據(jù)庫，用于檢疫性及危險性昆蟲的鑒定。通過比對數(shù)據(jù)庫中的基因條碼特征，可以確定未知昆蟲樣品的分類地位，并準確將其與近似種區(qū)分開來，有效避免了誤判，實現(xiàn)了精準鑒定。

2.4 分子生物學檢測技術對傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法仍有依賴性

形態(tài)學鑒定方法以生物遺傳規(guī)律為標準，對世界生物物種庫的建立起到了決定性作用。雖然近年來實時熒光定量PCR技術等分子生物學檢測技術在有害生物鑒定方面的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，但形態(tài)學鑒定技術仍具有不可替代性和自身優(yōu)勢。首先，分子生物學檢測技術的基本原理是采用DNA序列比較法，比較的前提是先采用形態(tài)學鑒定方法確定模式標本，因此，分子生物學檢測技術是建立在形態(tài)學鑒定的基礎之上的；其次，相比分子生物學技術，形態(tài)學鑒定仍是快速、簡便的檢測方法，也是我國進出境植物檢疫常用的檢測方法之一。

2.5 實時熒光定量PCR技術、DNA條形碼技術應用具備的優(yōu)勢及存在問題

實時熒光定量PCR技術、DNA條形碼技術通過分析物種條形碼序列，不僅可以實現(xiàn)快速、直接地為基于形態(tài)的分類系統(tǒng)提供必要信息，而且可以根據(jù)已知基因條碼進行精確定種，與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定相比具有定位誤差小、人為干擾少、依據(jù)充分可靠、檢測范圍大等優(yōu)勢，非常適合應用于進出境植物檢疫工作，尤其是在有害生物風險分析、處置外來有害生物突發(fā)事件、研究對外貿易技術壁壘、建立檢疫性有害生物基因數(shù)據(jù)庫、開展形態(tài)學鑒定能力驗證、活體非成蟲態(tài)有害生物的物種確認等方面有著不可估量的應用價值。雖然這2種技術已趨成熟，但現(xiàn)階段對于我國進出境植物檢疫工作來說仍存在以下不足：①外來有害生物特別是檢疫性有害生物基因條碼數(shù)據(jù)庫的建立尚處于初始階段，目前只有江蘇檢驗檢疫局植物檢疫實驗室等少數(shù)實驗室開展了相關研究工作，從全國范圍來講尚未形成合力，因此對其應用開展有一定制約性；②實時熒光定量PCR技術、DNA條形碼技術對設施設備要求高、專一性強，投入高且無收益，加上全國各口岸基礎條件不一，全面推廣尚有難度；③分子生物學檢測雖然解決了對專家的依賴性，但由于該技術對操作者的要求較高，需配置相應的專職人員才能開展；④由于此類技術的局限性，假陽性、檢測偏差等問題仍然存在。

3 分子生物學技術在進出境植物檢疫中的應用前景展望

分子生物學技術的發(fā)展為進出境植物檢疫檢測技術的進步創(chuàng)造了廣闊的空間，同時也為提高疫情疫病檢出率、有效防控外來有害生物入侵、研究對外貿易技術壁壘談判依據(jù)提供了強有力的技術支撐。隨著我國對外貿易的不斷擴大，進口小麥、油菜籽、大豆、木材等大宗農產品大量涌入我國，跨境電商等新興產業(yè)大行其道。在保障國門生物安全的前提下，進一步提高口岸通關速率，這些對我國進出境植物檢疫工作提出了新的挑戰(zhàn)和要求。實驗室檢測工作作為植物檢疫中必不可少的重要環(huán)節(jié)，承擔著重要使命，同時也面臨著巨大挑戰(zhàn)。實時熒光定量PCR技術、DNA條形碼技術作為目前分子生物學檢測常用的2種技術，基本實現(xiàn)了對有害生物的快速、簡便、準確檢測，但分子生物學檢測仍然依賴于傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定技術，而形態(tài)學鑒定作為目前我國進出境植物檢疫最主要的檢測方法，仍將是今后我國進出境植物檢疫工作中常用實驗室檢測方法之一。運用實時熒光定量PCR技術、DNA條形碼技術建立完整的外來有害生物物種基因數(shù)據(jù)庫、建立口岸植物檢疫PCR實驗室、完善有害生物檢測技術將成為今后一段時間內我國進出境植物檢疫的重要工作內容之一。隨著技術的不斷進步和試驗程序的持續(xù)優(yōu)化，在不久的將來，分子生物學檢測技術將成為我國進出境植物檢疫中最重要、最常用的技術手段。

參考文獻

[1] MONETTE P.葡萄莖尖組培苗中扇葉病毒的酶聯(lián)（ELISA）檢測[J].植物檢疫，1991，5（1）：20，21.

[2] 張成良，張作芳.酶聯(lián)免疫吸附技術：Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附法在檢測植物病毒上的應用[J].植物檢疫，1982（3）：15-33.

[3] CHUNG H W.Reverse transcriptase PCR （RTPCR） and quantitativecompetitive PCR （QCPCR）[J].Experimental & molecular medicine，2001，33（S1）：85-97.

[4] 趙光宇，李虎，楊梅林 等.DNA條形碼技術在昆蟲學中的應用[J].植物保護學報，2014，41（2）：129-141.

[5] ARMSTRONG K F，BALL S L. DNA barcodes for biosecurity：Invasive species identification[J].Philosophical transactions of the royal society B，2005，360：1813-1823.

[6] 黃海泉.實時熒光定量PCR技術在植物檢疫中應用的研究進展[J].湖北農業(yè)科學，2012，51（1）：5-8.

[7] 魏書軍，馬吉德，石寶才，等.我國新入侵外來害蟲美洲棘薊馬的外部形態(tài)和分子鑒定[J].昆蟲學報，2010，53（6）：715-720.

[8] 張桂芬，孟祥欽，萬方浩.西花薊馬檢測鑒定技術研究進展[J].生物安全學報，2011，20（1）：81-88.

[9] 詹國輝，樊新華，顧忠盈.基層動植物檢疫實驗室發(fā)展的思考[J].植物檢疫，2009，23（S1）：67-70.