滴滴涕脅迫對(duì)棘跳蟲的毒理研究

劉國(guó)翠

摘要 [目的]探討有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)土壤動(dòng)物的毒害作用。[方法]對(duì)棘跳蟲進(jìn)行不同濃度的滴滴涕（DDT）暴露脅迫，同時(shí)采用彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究棘跳蟲細(xì)胞DNA的損傷程度。[結(jié)果]棘跳蟲死亡率與DDT濃度呈明顯正相關(guān)；DDT對(duì)棘跳蟲24、48、72、96 h的半數(shù)致死濃度分別為31.83、24.28、17.15和13.93 μg/L，安全質(zhì)量濃度為1.39 μg/L。不同濃度的DDT暴露均能引起棘跳蟲細(xì)胞DNA的損傷，其最大損傷程度可達(dá)3級(jí)，且彗星尾長(zhǎng)、尾距及彗星尾部DNA含量變化與DDT濃度有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。[結(jié)論]試驗(yàn)首次選取跳蟲類作為指示動(dòng)物，通過(guò)在細(xì)胞水平探究有機(jī)農(nóng)藥DDT對(duì)棘跳蟲細(xì)胞DNA的損傷，為評(píng)估土壤污染物對(duì)土壤動(dòng)物的毒害機(jī)制提供了新思路。

關(guān)鍵詞 棘跳蟲；滴滴涕；半數(shù)致死濃度；DNA損傷

中圖分類號(hào) S482.3+2；X171.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）13-0151-03

Toxic Effects of Dichlorodiphenyltrichloroethane on the Springtails Onychiuyus fimeitayius linnaeus

LIU Guo-cui

（College of Life Sciences， Liaocheng University， Liaocheng， Shandong 252000）

Abstract [Objective] The aim was to study toxic effects of dichlorodiphenyltrichloroethane on the springtails Onychiuyus fimeitayius linnaeus. [Method] The effects of pp-dichlorodiphenyltrichloroethane （DDT） on DNA damage in the springtails of Onychiuyus fimeitayius linnaeus were studied by comet assay. Meantime， the mortality of the springtails was observed after different concentrations of DDT exposure. [Result] The DDT had significant toxic effect on the mortality of the springtails. The median lethal dose was 31.83， 24.28， 17.15， 13.93 μg/L on 24， 48， 72 and 96 h， respectively. The safe concentration was 1.39 μg/L. The DNA damage of springtails cells could be induced under the different mass concentrations of DDT， and the maximum damage degree could reach to 3 levels. The effects of DDT stress on comet tail length， tail length and DNA content in the tail of springtails cells were significantly related to the dose-effect relationship. [Conclusion] It provides a new idea to evaluate the toxicity mechanism of soil pollutants to soil animals， by using the springtails as the indicator animal.

Key words Onychiuyus fimeitayius linnaeus；Dichlorodiphenyltrichloroethane；Median lethal dose；DNA damage

棘跳蟲（Onychiuyus fimeitayius linnaeus）屬于無(wú)翅亞綱彈尾目跳蟲科的一類農(nóng)業(yè)昆蟲。由于較強(qiáng)的環(huán)境耐受力與繁殖力，棘跳蟲對(duì)蔬菜、食用菌等經(jīng)濟(jì)作物的危害日益嚴(yán)重，已成為制約經(jīng)濟(jì)作物健康發(fā)展的害蟲之一。

人工合成的有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕（DDT）因具有極好的殺蟲效果，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲及瘧疾和斑疹傷寒等蟲媒傳染病的控制。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)累計(jì)使用DDT總量達(dá)46.4萬(wàn)t，占世界DDT使用總量的 25.8%[1]。土壤是DDT最主要的環(huán)境介質(zhì)，人類活動(dòng)產(chǎn)生的大量DDT經(jīng)過(guò)各種途徑進(jìn)入土壤，通過(guò)食物鏈最終在動(dòng)物體脂肪組織內(nèi)高度富集，其蓄積系數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。調(diào)查顯示，DDT使用量最高的是華東和華北地區(qū)，其次是華南地區(qū)和新疆棉田地區(qū)[2-3]。

有關(guān)殺蟲劑對(duì)跳蟲類的防治工作已取得一定成效。陳先玉[4]通過(guò)觀察高效氯氰菊酯、溴氰菊酯等農(nóng)藥對(duì)棘跳蟲死亡率的影響，探究了相關(guān)殺蟲劑在蔬菜種植及防治跳蟲類侵害等方面的應(yīng)用。但目前相關(guān)研究?jī)H停留在害蟲防治的數(shù)量及暴發(fā)頻次上，相關(guān)有機(jī)殺蟲劑對(duì)跳蟲類昆蟲細(xì)胞水平的毒理研究仍然匱乏。鑒于此，筆者通過(guò)彗星電泳技術(shù)探究了不同濃度的有機(jī)氯農(nóng)藥DDT對(duì)棘跳蟲細(xì)胞DNA損傷的影響，以期從細(xì)胞水平揭示環(huán)境農(nóng)藥對(duì)跳蟲類昆蟲毒害的分子機(jī)制，為跳蟲類的防治及農(nóng)藥的劑量應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。

電泳儀（型號(hào)為DYY-7C），購(gòu)自北京六一儀器廠；熒光倒置顯微鏡（型號(hào)為IX71），購(gòu)自日本Olympus公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)為5702），購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；高壓蒸汽滅菌鍋（型號(hào)為YX280B），購(gòu)自上海三申醫(yī)療器械有限公司；電子天平（型號(hào)為AY220），購(gòu)自日本Shimadzu公司；純水儀（型號(hào)為MilliQ），購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.1.2 主要試劑與藥劑。

低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠購(gòu)自Biotech公司；Tris、DMSO、曲拉通X-100等均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；臺(tái)盼蘭、SYBR Green1熒光染料等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

pp-DDT 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；富鉻酵母購(gòu)自河北燕科生物科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物。

棘跳蟲于2015年9月采自聊城大學(xué)試驗(yàn)田。采用吸器挑選500只彈跳力較強(qiáng)的個(gè)體，體長(zhǎng)為（1.2±0.1） mm。于恒溫箱25 ℃馴養(yǎng) 7 d，期間喂食酵母菌。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥。

根據(jù)國(guó)內(nèi)DDT污染狀況與預(yù)試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)濃度的DDT酵母溶液，分別為0、5、10、20、40 μg/L。以DMSO作為溶劑配制40 μg/L母液，然后分別稀釋至各濃度。試驗(yàn)處理組均設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行30只棘跳蟲，容器為600 mL聚乙烯盒。試驗(yàn)期間每天于固定時(shí)間喂食含不同濃度DDT的酵母溶液。

1.2.2 彗星試驗(yàn)方法。

于暴毒96 h時(shí)分別采集不同DDT濃度暴露下的棘跳蟲，進(jìn)行DNA損傷探究試驗(yàn)。彗星電泳方法參照 Singh 等[5]的方法并略加改進(jìn)，采用三明治凝膠法。制膠前用0.5%臺(tái)酚藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，于4 ℃下鋪膠；待凝膠完全凝固后，將制備好的凝膠片放入新鮮配制的預(yù)冷的裂解液裂解1 h，4 ℃蒸餾水漂洗掉表層裂解液后，將載玻片移入盛有新鮮配制的預(yù)冷的電泳液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13）的電泳槽的陽(yáng)極端解旋30 min；待雙鏈DNA解旋后于電壓25 V、電流300 mA環(huán)境下電泳30 min；電泳完畢后，用Tris-HCl浸泡膠片5 min，后經(jīng)50%、70%、90%、100%等濃度乙醇脫水，然后于4 ℃冰箱中保存凝膠玻片。7 d內(nèi)取出膠條，經(jīng)SYBR Green1染色后于熒光顯微鏡下觀察、拍攝單細(xì)胞電泳圖像用于熒光分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

分別于24、48、72、96 h在顯微鏡下觀察記錄棘跳蟲的生存及死亡情況，以玻璃棒碰觸蟲體10 s內(nèi)無(wú)肢體反應(yīng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)。利用CASP 1.2.2軟件分析彗星圖像[6]，檢測(cè)指標(biāo)包括彗星尾長(zhǎng)（TL）、Olive 尾距（OTM）、彗星尾部DNA百分含量（Tail DNA%）。TL反映了損傷產(chǎn)生的DNA片段移動(dòng)的距離；Tail DNA%=尾部 DNA 熒光強(qiáng)度/（頭部 DNA 熒光強(qiáng)度+尾部 DNA 熒光強(qiáng)度）×100%；OTM=尾部重心至頭部重心距離×尾部 DNA 百分比。

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行各時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)致死濃度（LC50）計(jì)算及單因素方差分析，同時(shí)采用Duncans多重比較法分析各組間的差異顯著性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DDT對(duì)棘跳蟲死亡率的影響

由圖1可知，隨暴毒時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度的棘跳蟲死亡率均呈上升趨勢(shì)，與空白對(duì)照組差異顯著；最大死亡率出現(xiàn)在96 h的最高濃度組。同時(shí)，相同濃度的DDT暴露組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，棘跳蟲死亡率也呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，DDT暴露對(duì)棘跳蟲24、48、72、96 h的LC50分別為31.83、24.28、17.15和13.93 μg/L，其安全質(zhì)量濃度為1.39 μg/L。總體而言，各時(shí)間點(diǎn)LC50、95%置信區(qū)間（CI）及各時(shí)間致死濃度表現(xiàn)出良好的時(shí)間-劑量效應(yīng)。隨DDT暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其LC50呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，于96 h達(dá)到最低值（表1）。

2.2 DDT對(duì)棘跳蟲DNA的損傷

由圖2可知，在熒光顯微鏡下，DNA片段被SYBR Green1核酸染料染成翠綠色。在DMSO對(duì)照組中，細(xì)胞呈圓形熒光頭部，并未發(fā)現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，表明在溶劑對(duì)照組細(xì)胞中未發(fā)生DNA鏈的斷裂（圖2-a）。隨著DDT暴露濃度的升高，棘跳蟲細(xì)胞DNA鏈斷裂情況愈加嚴(yán)重，表現(xiàn)為DNA斷片離頭部向陽(yáng)極方向遷移，在激發(fā)光下呈現(xiàn)可見的慧星樣拖尾（圖2-b～e）。且濃度越高，彗星尾部拖尾越嚴(yán)重，表明隨著DDT濃度的升高，棘跳蟲細(xì)胞DNA損傷程度愈加嚴(yán)重。

由圖3可知，不同質(zhì)量濃度DDT暴露均能引起棘跳蟲細(xì)胞DNA的損傷，表現(xiàn)為彗尾DNA含量（Tail DNA%）的增加、彗尾長(zhǎng)度（TL）加長(zhǎng)、Olive尾矩（OTM）增加。3個(gè)指標(biāo)間存在較高的相關(guān)性，說(shuō)明采用以上3個(gè)指標(biāo)，可以很好地反映跳蟲細(xì)胞DNA的損傷狀況。根據(jù)彗星尾部DNA百分含量，可將DNA損傷的程度分為5級(jí)[7]。以此指標(biāo)，溶劑對(duì)照組Tail DNA%<5%，無(wú)損傷；5和10 μg/L濃度組Tail DNA%在5%～20%，屬于中度損傷中的1級(jí)損傷；20 μg/L濃度組Tail DNA%在20%～40%，屬于中度損傷里的2級(jí)損傷；最高濃度組（40 μg/L）Tail DNA%含量在40%～95%，屬于重度損傷里的3級(jí)損傷。

3 結(jié)論與討論

彗星電泳又稱單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE），因其靈敏、簡(jiǎn)便、快捷等特點(diǎn)，被廣泛用于檢測(cè)DNA遺傳損傷細(xì)胞凋亡、生態(tài)毒理等領(lǐng)域。目前，利用彗星電泳技術(shù)監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境的污染狀況已被列入國(guó)際通用手段[8]，而在土壤污染物環(huán)境監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用鮮見相關(guān)報(bào)道。以DDT為代表的殺蟲劑類藥物在土壤中的積累會(huì)破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[9]。同時(shí)，一定濃度的DDT積累可引起昆蟲乃至高等動(dòng)物機(jī)能亢進(jìn)和驚厥，最終導(dǎo)致死亡[10]。跳蟲作為土壤中的一類優(yōu)勢(shì)種群，不但基數(shù)大，對(duì)土壤污染物刺激也十分敏感，具有成為土壤環(huán)境質(zhì)量指示生物的潛力[11]。結(jié)合該研究可以發(fā)現(xiàn)，在DDT暴露24 h內(nèi)，棘跳蟲已對(duì)低濃度的DDT暴露（5 μg/L）產(chǎn)生反應(yīng)，同時(shí)彗星結(jié)果同樣顯示DDT低濃度組對(duì)棘跳蟲細(xì)胞DNA造成嚴(yán)重?fù)p傷。以上結(jié)果證實(shí)，跳蟲對(duì)土壤有機(jī)氯類農(nóng)藥污染物反應(yīng)靈敏，可嘗試用于土壤環(huán)境污染物的檢測(cè)評(píng)估。

受限于土壤污染評(píng)價(jià)方法，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究集中在檢測(cè)污染物的濃度分布狀況等方面，而很少將污染物與指示生物二者之間結(jié)合起來(lái)評(píng)價(jià)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于土壤污染物毒理的研究主要集中在探究相關(guān)污染物對(duì)蚯蚓的毒理及DNA的損傷狀況，以此來(lái)評(píng)價(jià)土壤污染物對(duì)生物體的生理機(jī)制[12]。因此，從生物機(jī)制層面探究一種對(duì)土壤有機(jī)污染物毒害作用的快速有效的檢測(cè)方法，已成為當(dāng)務(wù)之急。

該研究通過(guò)對(duì)棘跳蟲細(xì)胞SCGE試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DDT脅迫對(duì)棘跳蟲細(xì)胞的彗星尾長(zhǎng)、尾距及彗星尾部DNA含量影響有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且3個(gè)指標(biāo)具有很好的一致性。說(shuō)明不同濃度的DDT脅迫均對(duì)棘跳蟲細(xì)胞造成了不同程度的損傷，且彗星的3個(gè)指標(biāo)可以很好地用于DDT毒理評(píng)價(jià)的聯(lián)合指標(biāo)。說(shuō)明利用跳蟲作為指示生物，通過(guò)探究土壤環(huán)境中有機(jī)污染物對(duì)跳蟲類的DNA損傷，可以快速有效地評(píng)價(jià)土壤污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

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