丁香酚對鯉魚腦中cAMP濃度的影響

李慧雯+肖亞林+孫文淵+譚艾娟+呂世明

摘要 [目的]通過檢測丁香酚對鯉魚腦中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度變化的影響，探討cAMP在麻醉機(jī)制中的作用。[方法]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）間接法測定鯉魚被丁香酚麻醉后不同腦區(qū)在誘導(dǎo)期、麻醉期和復(fù)蘇期的cAMP濃度。[結(jié)果]與對照組相比，誘導(dǎo)期組鯉魚各腦中cAMP濃度極顯著地升高（P<0.01）。[結(jié)論]丁香酚麻醉鯉魚的作用可能與提高腦內(nèi)cAMP濃度、調(diào)節(jié)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 鯉魚；丁香酚；腦；cAMP；麻醉作用

中圖分類號 S948 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）10-0232-01

Abstract [Objective]To explore the anesthetic mechanism of eugenol on carp，the concentration change of cyclic adenosine monophosphate（cAMP）in carp brain was detected.[Method]Using the test method of enzyme linked immunosorbent assay （ELISA），the cAMP concentration in different brain regions of carp in the period of anesthesia induction，anesthesia and recovery were determined.[Results]Compared with the control group，the cAMP concentration of the brain in anesthesia group was increased significantly（P<0.01）.[Conclusion]There might be a relationship between the anesthetic effect of eugenol to carp to raise the concentrations of cAMP and regulate the cAMP signal transmission system in carp brains.

Key words carp；eugenol；brain；cAMP；anesthetic effect

麻醉劑能夠使魚體安靜，降低應(yīng)激反應(yīng)，減少人為操作和運(yùn)輸過程中對魚體的傷害，從而提高成活率[1]，增加經(jīng)濟(jì)效益。丁香酚廣泛存在于丁香油、樟腦油、肉豆蔻油等芳香油中[2-3]，是一種毒副作用小、無殘留的天然、理想的魚類麻醉劑[4-5]，但其麻醉作用機(jī)理還不明確。本研究從中樞環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量的角度考察丁香酚對鯉魚不同腦區(qū)cAMP濃度的影響，以探討丁香酚對鯉魚不同腦區(qū)cAMP的影響機(jī)理，為丁香酚麻醉鯉魚可能的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑。丁香酚（Xiya Reagen）：純度 99.0%；吐溫80（Solarbio）：純度99.5%；司班80（Xiya Reagen）：純度 99.9%；cAMP測定試劑盒：南京建成生物有限公司。

1.1.2 主要儀器。TG16—W微量高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)；FA2004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀：北京普天新橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)動物。鯉魚體重900～1 000 g，體長40～45 cm，試驗(yàn)前喂養(yǎng)于20～22 ℃水中1周，試驗(yàn)前均停食1 d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 丁香酚乳液的配制。按吐溫80∶司盤80∶無水乙醇∶丁香酚=4∶2∶1∶2的比例配制乳液[6]，充分?jǐn)嚢杈鶆?，最后緩慢加入水，靜置10 min后備用。

1.2.2 分組處理與腦組織樣品采集。取試驗(yàn)用魚36條，隨機(jī)分為對照組（9條）和丁香酚處理組（27條），將丁香酚處理組鯉魚置于含40 mg/L丁香酚乳液的水中麻醉，當(dāng)鯉魚分別處于誘導(dǎo)期、麻醉期和麻醉后恢復(fù)期時各取9條；解剖魚頭部，在冰面上迅速分離端腦、中腦、小腦、間腦、延腦和脊髓，置于液氮中冷凍保存。麻醉各期判定標(biāo)準(zhǔn)參照張福林[7]的研究成果。

1.2.3 cAMP樣品的制備與測定。將待測的腦組織從液氮罐中取出，用預(yù)冷的生理鹽水按組織（g）∶生理鹽水（mL）=1∶9的比例加入玻璃勻漿器中，于4 ℃的環(huán)境中充分研磨。將所得勻漿液移至離心管中，離心10 min（3 000 r/min），取上清液，參照cAMP測定試劑盒操作方法測定各腦和脊髓中cAMP的含量。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，應(yīng)用SPSS 17.0 for Windows數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件分析。

2 結(jié)果與分析

由表1可見，在丁香酚乳劑麻醉過程中，隨著麻醉的加深，鯉魚端腦、中腦、小腦、間腦、延腦和脊髓內(nèi)cAMP 濃度都不同程度地增高。誘導(dǎo)期組中腦內(nèi)cAMP濃度極顯著高于對照組（P<0.01），小腦內(nèi)cAMP濃度顯著高于對照組（P<0.05）。麻醉期組各腦組織和脊髓中cAMP濃度極顯著高于對照組（P<0.01）?；謴?fù)期組與麻醉期組相比較，除間腦外，各腦組織與脊髓中cAMP 濃度極顯著地下降（P<0.01），而與對照組差異不明顯。鯉魚各個腦區(qū)cAMP濃度變化趨勢與鯉魚行為學(xué)變化呈一定規(guī)律，即丁香酚乳劑麻醉之后，隨著鯉魚意識、反射、軀體行動及運(yùn)動等受抑制程度的加深，cAMP濃度相應(yīng)增強(qiáng)，之后鯉魚從麻醉中逐漸恢復(fù)后cAMP濃度也相應(yīng)下降。因此，丁香酚對鯉魚的麻醉可能與中樞中cAMP通路有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是機(jī)體內(nèi)的重要物質(zhì)，被稱為細(xì)胞第二信使[8]。廣泛存在于各種細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要成分，在神經(jīng)興奮性、突觸傳遞及細(xì)胞功能代謝等方面具有重要作用。cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通過PKA使鈉通道蛋白質(zhì)磷酸化，減少鈉離子內(nèi)流，減弱神經(jīng)元之間的興奮傳遞[9]。cAMP還可通過PKA調(diào)節(jié)與麻醉有關(guān)的受體和通道，影響突觸的興奮傳遞，從而達(dá)到麻醉作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，cAMP在某些神經(jīng)遞質(zhì)引起的膜電位變化中起中介作用，并對某些神經(jīng)遞質(zhì)起調(diào)制作用[10]。鈉通道是一種跨膜糖蛋白，是可興奮細(xì)胞動作電位產(chǎn)生和傳播的關(guān)鍵因素。許多麻醉藥可作用于鈉離子通道。Tibbs等[11]證實(shí)PKA通過cAMP依賴性蛋白激酶錨定蛋白（AKAP）相互作用連接于腦內(nèi)鈉通道。cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與鈉離子有密切的聯(lián)系。cAMP信使系統(tǒng)通過PKA使鈉通道蛋白質(zhì)磷酸化，減少鈉離子內(nèi)流，減弱神經(jīng)元之間的興奮傳遞。研究表明，cAMP在麻醉藥的作用機(jī)理中發(fā)揮重要作用[12-14]。此外，還有研究表明，cAMP的含量與腫瘤的治療呈正相關(guān)[15]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在丁香酚乳劑麻醉過程中，隨著麻醉的加深，鯉魚端腦、中腦、小腦、間腦、延腦和脊髓內(nèi)cAMP濃度都不同程度增高，而恢復(fù)期各腦組織和脊髓內(nèi)cAMP濃度顯著下降，鯉魚腦內(nèi)cAMP濃度變化與魚體麻醉后的行為變化基本一致。提示丁香酚可能是通過提高腦內(nèi)cAMP濃度、調(diào)節(jié)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)而發(fā)揮麻醉作用。

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