高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定雞蛋中頭孢噻肟及其主要代謝物殘留

楊小體++湯曉艷++沈習(xí)習(xí)++張小慶

摘要 建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（PLCM/M）法同時(shí)測(cè)定雞蛋中頭孢噻肟及其代謝物去乙酰頭孢噻肟殘留量的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈水（9∶1， V/V）提取，正己烷除脂，C18固相分散萃取除雜，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×21 mm， 35 μm）分離，以02%（V/V）甲酸乙腈為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，目標(biāo)物采用電噴霧正離子（EI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，頭孢噻肟和去乙酰頭孢噻肟分別在10～1430 μg/L和10～1200 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0999）。方法檢出限（LOD， /N=3）分別為007和014 μg/kg，定量限（LOQ， /N=10）分別為023和099 μg/kg。 在50、500和1000 μg/kg 3個(gè)添加水平下，頭孢噻肟和去乙酰頭孢噻肟的回收率分別為831%～1030%和882%～1010%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RD， n=6）均介于20%～62%。實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確， 可用于雞蛋中頭孢噻肟及去乙酰頭孢噻肟的殘留分析檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 雞蛋； 頭孢噻肟； 去乙酰頭孢噻肟； 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引 言

頭孢噻肟（Cefotaxime， CX）為半合成的第三代人用頭孢菌素，屬于β內(nèi)酰胺類抗生素，具有廣譜、高效、耐酶等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床已有30余年。頭孢噻肟在肝內(nèi)代謝為有活性的去乙酰頭孢噻肟和幾種無(wú)活性的其它代謝物＼[1，2＼]。頭孢噻肟及去乙酰頭孢噻肟的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告＼[3＼]明文規(guī)定，未辦理獸藥、飼料添加劑審批手續(xù)的人用藥品，不得直接用于飼料生產(chǎn)和飼養(yǎng)過(guò)程，而且頭孢噻肟作為禁用藥也在農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告＼[4＼]中的獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄中。但由于頭孢噻肟對(duì)獸醫(yī)臨床上常見的病原菌（如大腸桿菌、雞鴨沙門氏菌、肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌等）療效突出＼[5～7＼]，近年被大量用于家禽飼養(yǎng)中，因而不可避免地殘留在畜禽組織及其制品中＼[8，9＼]，造成食品安全隱患，同時(shí)也會(huì)加劇細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題，給人類感染性疾病的預(yù)防和控制帶來(lái)困難。隨著該類藥物的代謝機(jī)理、毒理和殘留研究的不斷深入，世界各國(guó)政府及有關(guān)國(guó)際組織已高度重視該類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留問(wèn)題，對(duì)許多頭孢類抗生素的殘留量都制定了非常嚴(yán)格的要求。頭孢噻肟由于過(guò)去很少獸用，目前歐盟、美國(guó)、日本以及我國(guó)均未對(duì)該藥在動(dòng)物中的殘留限量做出相關(guān)規(guī)定。

為保障食品安全及人類健康，針對(duì)頭孢噻肟在畜禽中濫用的現(xiàn)象，亟需對(duì)其進(jìn)行有效的監(jiān)管監(jiān)測(cè)。頭孢噻肟在機(jī)體內(nèi)代謝迅速，不易檢出，因而對(duì)于其代謝物的檢測(cè)至關(guān)重要＼[10，11＼]。但目前報(bào)道的關(guān)于頭孢噻肟的檢測(cè)方法，如分光光度法＼[12＼]、高效毛細(xì)管電泳（PCE） ＼[13，14＼]、高效液相色譜（PLC）法＼[15＼]等，主要針對(duì)頭孢噻肟原型，而對(duì)于其代謝物的研究?jī)H有針對(duì)腦脊液、血漿等非食用性基質(zhì)建立的高效液相色譜方法，且定量限大于100 μg/kg＼[16～18＼]，達(dá)不到動(dòng)物源性食品殘留檢測(cè)的要求。本研究采用PLCM/M法建立了同時(shí)測(cè)定雞蛋中頭孢噻肟及其主要代謝物去乙酰頭孢噻肟殘留量的檢測(cè)方法，并應(yīng)用于陽(yáng)性雞蛋樣品的檢測(cè)分析。結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可為頭孢噻肟在動(dòng)物源性食品中殘留檢測(cè)和生產(chǎn)監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

1200 series高效液相色譜（美國(guó)Agilent echnologies公司）； QRAP5000三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB ciex質(zhì)譜系統(tǒng)公司）； Biofugetratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)賀力氏公司）； LDCII型氮?dú)鉂饪s儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）； X105DM電子天平（瑞士Mettler oledo公司）； 培英ZP400振蕩器（蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； VOREX5渦旋振蕩器（海門市其林貝爾有限公司）； MilliQ超純水器（美國(guó)Millipore公司）； 超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）。

頭孢噻肟鈉標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥995%，上海源葉生物科技有限公司）； 去乙酰頭孢噻肟標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，加拿大RC公司）； 甲醇（PLC級(jí)，德國(guó)Merck公司）； 乙腈（PLC級(jí)，美國(guó)JBaker公司）； 甲酸（PLC級(jí)，美國(guó)Mreda ecnology公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ純水儀制備的超純水（≥18 MΩ·cm）

22標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以甲醇水（1∶1， V/V）為溶劑分別配制143 mg/L頭孢噻肟鈉和120 mg/L去乙酰頭孢噻肟標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于棕色容量瓶中低溫避光短期保存。測(cè)定當(dāng)天用甲醇水（1∶1， V/V）逐級(jí)稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

23樣品處理

準(zhǔn)確稱取已混勻的全蛋樣品（10±001） g，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈水（9∶1， V/V），渦旋30 s，振蕩20 min提取，8000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一個(gè)50 mL離心管中，加入5 mL乙腈飽和正己烷除脂，渦旋30 s，振蕩10 min，5000 r/min離心10 min，取下層溶液5 mL于10 mL離心管中，加入100 mg C18凈化后，轉(zhuǎn)移上清液于40℃以下水浴氮吹濃縮至干，以1 mL甲醇水（1∶1， V/V）復(fù)溶，經(jīng)022 μm濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

24色譜條件

Agilent Eclipse C18色譜柱（100 mm×21 mm， 35 μm）； 流動(dòng)相A為02% （V/V）甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈； 柱平衡時(shí)間1 min； 梯度洗脫程序：0～10 min，95% A； 10～30 min，95%～60% A； 30～50 min，60% A； 51～70 min，95% A； 流速03 mL/min； 進(jìn)樣體積5 μL； 外標(biāo)法定量。

25質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（EI）； 檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）； 掃描方式：正離子掃描； 碰撞氣（CAD）壓力為8 MPa； 氣簾氣（CMR）壓力為35 MPa； 霧化氣（G1）壓力為55 MPa； 干燥氣（G2）壓力為55 MPa； 電噴霧電壓（I）為5500 V； 離子化溫度（EM）為550 ℃； MRM定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）及碰撞電壓（CE）見表1。

3結(jié)果與討論

31前處理方法優(yōu)化

頭孢類抗生素多采用不同濃度的甲酸水、乙腈水、甲醇作為提取劑＼[19＼]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，乙腈水（9∶1， V/V）作為提取劑時(shí)，提取液清澈，蛋白質(zhì)沉淀完全，回收率較高； 甲酸水作為提取劑的回收率相對(duì)較低，原因可能是頭孢噻肟在酸性溶液中不穩(wěn)定，氮吹水浴時(shí)分解所致。

QuEChER作為一種簡(jiǎn)單快速的樣品前處理方法，近年被逐漸應(yīng)用于β內(nèi)酰胺類藥物的前處理中＼[20＼]。鑒于動(dòng)物組織中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，應(yīng)針對(duì)不同的樣品基質(zhì)，選擇合適的提取溶劑和吸附劑。目前，動(dòng)物源性食品常用C18和PA作為吸附劑吸附雜質(zhì)，C18為非極性吸附劑，主要去除脂類和弱極性雜質(zhì)； PA為弱陰離子交換劑，主要去除有機(jī)酸、金屬離子和酚類等＼[21＼]。本實(shí)驗(yàn)考察了PA和C18對(duì)頭孢噻肟鈉及其主要代謝物去乙酰頭孢噻肟的凈化效果，結(jié)果表明，PA對(duì)目標(biāo)物有吸附作用，而C18對(duì)頭孢噻肟鈉和去乙酰頭孢噻肟幾乎無(wú)吸附，凈化效果較好，目標(biāo)物回收率均在831%～1030%之間。此外，本實(shí)驗(yàn)也采用LiChrolut RP18柱和LB柱等傳統(tǒng)的固相萃方式對(duì)雞蛋樣品進(jìn)行了凈化，發(fā)現(xiàn)去乙酰頭孢噻肟回收率只有30%～40%，相比之下，QuEChER方法具有回收率高，簡(jiǎn)便快速，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，更適用于大批量樣品的殘留檢測(cè)。

32色譜質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化

在正離子模式下，頭孢噻肟和去乙酰頭孢噻肟主要以＼[M+＼]+分子離子峰形式存在，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2和圖3。質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，以頭孢噻肟的分子離子m/z 4561為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到特征離子峰m/z 3961和 3241； 以去乙酰頭孢噻肟的分子離子m/z 4141為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到特征離子峰m/z 241和285； 其中m/z 241為β內(nèi)酰胺環(huán)主要裂解碎片，且豐度最高，m/z 285為β內(nèi)酰胺環(huán)較為特殊的開環(huán)方式＼[22＼]。

頭孢類抗生素常用的流動(dòng)相為水、甲酸溶液、乙酸銨溶液與乙腈、甲醇等＼[23～25＼]。本研究以Agilent Eclipse C18色譜柱（100 mm×21 mm， 35 μm）為分析柱。流動(dòng)相的水相分別考察了純水、01%和02%（V/V）的甲酸溶液、乙酸銨溶液（以甲酸調(diào)至p 45）； 有機(jī)相分別考察了乙腈、01%和02%（V/V）甲酸乙腈、甲醇，在同一色譜條件下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行梯度洗脫分離。結(jié)果表明，使用02%（V/V）甲酸乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，頭孢噻肟鈉和去乙酰頭孢噻肟的峰形、分離度與靈敏度均優(yōu)于上述其它流動(dòng)相，結(jié)果如圖4B所示，因此本研究選用02%（V/V）甲酸乙腈作為流動(dòng)相。

實(shí)驗(yàn)表明，甲醇或純水復(fù)溶效果均不理想，頭孢噻肟鈉和去乙酰頭孢噻肟保留性差，峰形易受基質(zhì)干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同比例的甲醇水的復(fù)溶效果也進(jìn)行了考察，最后確定以甲醇水（1∶1， V/V）作為復(fù)溶液，目標(biāo)物的出峰時(shí)間、分離度、峰型均能達(dá)到理想效果。

33方法檢出限和定量限

分別以信噪比/N≥3及/N≥10確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得到頭孢噻肟和去乙酰頭孢噻肟的檢出限分別為007和014 μg/kg； 定量限分別為023和099 μg/kg。

34方法的線性范圍、回收率和精密度

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)頭孢噻肟和去乙酰頭孢噻肟進(jìn)行分析。準(zhǔn)確吸取適量頭孢噻肟鈉和去乙酰頭孢噻肟的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入到按23節(jié)方法處理過(guò)的空白樣品提取液中，使溶液中頭孢噻肟鈉的濃度分別為1、6、36、72和144 μg/L，去乙酰頭孢噻肟的濃度分別為1、10、30、60和120 μg/L，以峰面積和質(zhì)量濃度作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取空白雞蛋樣品，分別添加5、50和100 μg/kg 3個(gè)水平濃度的頭孢噻肟鈉和去乙酰頭孢噻肟混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度作6個(gè)平行樣，按本方法測(cè)定回收率。線性方程、加標(biāo)回收率及精密度如表2所示。

35實(shí)際樣品分析

以頭孢噻肟在蛋雞養(yǎng)殖中的常用劑量20 mg/kg對(duì)實(shí)驗(yàn)蛋雞連續(xù)5天肌注給藥，并于停藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集雞蛋樣品，應(yīng)用本方法測(cè)定其中頭孢噻肟及去乙酰頭孢噻肟的殘留量。經(jīng)檢測(cè)分析，空白、加標(biāo)樣品和停藥1 d后的雞蛋樣品LCM/M總離子流色譜圖見圖4。停藥20天后，雞蛋樣品中仍可檢測(cè)到頭孢噻肟和去乙酰頭孢噻肟，殘留濃度分別為325和48 μg/kg，說(shuō)明此藥在雞蛋中消除非常緩慢，因此，雞蛋可作為蛋雞養(yǎng)殖中監(jiān)測(cè)頭孢噻肟違規(guī)使用的靶組織。

4結(jié) 論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定雞蛋中頭孢噻肟及其主要代謝物去乙酰頭孢噻肟的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCM/M）方法。本方法樣品前處理簡(jiǎn)便快速，回收率高，定量限及精密度均能滿足殘留檢測(cè)要求，解決了此藥在動(dòng)物組織由于殘留低、易代謝轉(zhuǎn)化而難于監(jiān)測(cè)的問(wèn)題，為此藥在畜禽養(yǎng)殖中違禁使用的監(jiān)管監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

References

1arding M， Monro A J， hornton J E， Ayrton J， ogg M I J Antimicrob Chemotherapy， 1981， 8， upplB（4）： 263-272

2Jacobs R F， Kearns G L Diagnostic Microbiol Infect Dis， 1989， 12（1）： 93-99

3Ministry of Agricultrue No 176 Bulletin of the Ministry of Agricultrue of the People′s Republic of China， ＼[20020209＼]

農(nóng)業(yè)部 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第176號(hào)公告，＼[20020209＼]

4Ministry of Agricultrue No 560 Bulletin of the Ministry of Agricultrue of the People′s Republic of China， ＼[20051028＼]

農(nóng)業(yè)部 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第560號(hào)，＼[20051028＼]

5ering J， Frmke C， Von M C， artmann M， chneider B， Friese A， Rsler U， KreienbrockL， ille K Prevent Vet Med， 2016， 125： 154-157

6De J A， met A， Ludwig C， tephan B， De Graef E， Vanrobaeys M， aesebrouck F Vet Microbiol， 2014， 171（34）： 298-306

7Muhtadi F J， assan M M A Anal Profiles Drug ubstances， 1982， 11： 139-168

8Collignon P， Aarestrup F M， Irwin R， Mcewen Emerg Infect Dis， 2013， 19（8）： 1339-1340

9Lin L， Xu X， Ren X， Cui Microb Drug Resistance， 2014， 20（1）： 73-81

10Fu K P， Aswapokee P， o I， Matthijssen C， Neu C Antimicrob Agent Chemotherapy， 1979， 16（5）： 592-597

11Chamberlain J， Coombes J D， Dell D， Fromson J M， Ings R J， Macdonald C M， McEwen J J Antimicrob Chemotherapy， 1980， 6（uppl A）： 69-78

12Bushra M U， ossain M ， Ahmed K ， Nesa J U， Mahmud M F Inter J Pharmaceut ci Res， 2014， 4（1）： 74-77

13CEN DingDing， E DongXu， QI KeZong， LU CuiZhen Journal of Instrumental Analysis， 2012， （10）： 1334-1338

陳玎玎， 何東旭， 祁克宗， 陸翠珍 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2012， （10）： 1334-1338

14E DongXu， MENG ianuan， CEN DingDing， QI KeZong Journal of Animal cience & Veterinary Medicine， 2008， 27（6）： 5-7

何東旭， 孟歡歡， 陳玎玎， 祁克宗 畜牧獸醫(yī)雜志， 2008， 27（6）： 5-7

15Verdier M C， ribut O， attevin P， Le ulzo Y， Michelet C， BentuéFerrer D Antimicrob Agents Chemotherapy， 2011， 55（10）： 4873

16akim L， Bourne D W A， riggs E J J Chromatogr， 1988， 424（1）： 111

17Rosseel M ， Vandewoude K J Chromatogr B， 2004， 811（2）： 159

18canes ， undt A F， wart K J， undt K J Chromatogr B， 2001， 750（1）： 171

19UN Lei， ZANG Li， WANG Xia， WANG huuai， BI YanFeng， XU Qian Journal of Instrumental Analysis， 2009， （5）： 576-580

孫 雷， 張 驪， 汪 霞， 王樹槐， 畢言鋒， 徐 倩 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2009， （5）： 576-580

20Guo C， Wang M， Xiao ， uai B， Wang F， Pan G， Liao X， Liu Y J Chromatogr B， 2016， 1027： 110

21CUI FengYun， ZANG Chaoui， LI Jianui， UANG ua， YAN ua， YUN uan， LIU Xin， QI eMing， E Yue， XU Xiang Journal of Food afety and Quality， 2016， 7（2）： 575-583

崔鳳云， 張朝暉， 李建輝， 黃 華， 嚴(yán) 華， 云 環(huán)， 劉 鑫， 齊鶴鳴， 何 悅， 許 翔 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)， 2016， 7（2）： 575-583

22WANG Wei， ZANG ongen， GUO hiEn Journal of Engineering of eilongjiang University， 2012， （04）： 33-37

王 威， 張宏森， 郭世恩 黑龍江大學(xué)工程學(xué)報(bào)， 2012， （04）： 33-37

23Chen D， Yu J， ao Y， Pan Y， Xie ， uang L， Peng D， Wang X， Wang Y， Liu Z， Yuan Z J Chromatogr B， 2016， s1017-1018： 82-88

24LI XueMin， CAO YanZhong， ZANG JinJie， FAN ChunLin， LIU XiaoMao， QIAN XiaoQing Chinese J Anal Chem， 2010， 38（5）： 735-739

李學(xué)民， 曹彥忠， 張進(jìn)杰， 范春林， 劉曉茂， 錢小清 分析化學(xué)， 2010， 38（5）： 735-739

25LIU ChuangJi， WANG ai， DU ZhenXia， JIANG YanBin， AN Jiao， CAI Yingua Chinese J Anal Chem， 2011， 39（5）： 617-622

劉創(chuàng)基， 王 海， 杜振霞， 姜艷彬， 單吉浩， 蔡英華 分析化學(xué)， 2011， 39（5）： 617-622