三陰性乳腺癌患者外周血及腫瘤組織中CD4+ T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1的表達(dá)及其臨床意義

徐本玲 袁鵬 陳廣玉 王振雷 袁龍

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 河南 鄭州 450008)

三陰性乳腺癌患者外周血及腫瘤組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1的表達(dá)及其臨床意義

徐本玲 袁鵬 陳廣玉 王振雷 袁龍

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 河南 鄭州 450008)

目的 探討三陰性乳腺癌(BC)患者外周血、腫瘤組織和癌旁組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1的表達(dá)與BC疾病進(jìn)展的關(guān)系。方法 收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科2013年1月至2014年1月收治的52例BC患者全血標(biāo)本，并同時(shí)收集其中7例Ⅲ期患者的腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本，采用密度梯度離心法分離獲得組織中的淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1的表達(dá)水平。結(jié)果 52例BC患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3、PD-1和Tim-3+PD-1+的表達(dá)水平明顯高于其在22例健康人外周血中的表達(dá)水平(Tim-3∶2.74%比1.7%，P=0.026 4；PD-1∶17.15%比11.8%，P=0.000 6；Tim-3+PD-1+∶2.23%比1.13%，P=0.006 6)。Ⅲ/Ⅳ期BC患者外周血CD4+T細(xì)胞上Tim-3+PD-1+的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期BC患者(3.23%比1.66%，P=0.021 6)及健康人。BC患者腫瘤組織中CD4+細(xì)胞表面Tim-3，PD-1和Tim-3+PD-1+的表達(dá)水平高于癌旁組織和外周血。結(jié)論 BC患者外周血及腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞上抑制性受體Tim-3和PD-1的表達(dá)水平升高，可能是CD4+T細(xì)胞參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，促進(jìn)BC病情進(jìn)展的機(jī)制之一。

乳腺癌；CD4+T淋巴細(xì)胞；T細(xì)胞耗竭；T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子3；程序性死亡分子1

乳腺癌(breast cancer，BC)是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害女性身體健康的惡性腫瘤[1]，尤其是三陰性BC，因其雌激素受體、孕激素受體及HER-2受體均為陰性，對(duì)化療及內(nèi)分泌治療效果均很差，亟需尋找新的治療策略以提高患者的預(yù)后[2]。BC患者的預(yù)后不僅取決于腫瘤本身的特點(diǎn)，更重要的是還取決于機(jī)體與腫瘤的相互作用。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)尤其是T細(xì)胞在清除或控制腫瘤形成中發(fā)揮重要作用，T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)多個(gè)抑制性受體與耗竭的程度有關(guān)。近年來(lái)，CD4+T細(xì)胞作為機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要構(gòu)成部分之一，其在腫瘤免疫治療中的作用逐漸引起人們的重視。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim-3) 和程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)是T細(xì)胞表面重要的共抑制分子，介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)[3-4]。在一項(xiàng)關(guān)于免疫檢查點(diǎn)的研究中，Tim-3在腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在荷瘤動(dòng)物模型中，Tim-3+CD8+T細(xì)胞亞群顯示更強(qiáng)的被抑制特性，并且出現(xiàn)功能障礙。封閉Tim-3則可以獲得和封閉PD-1相似的抗腫瘤效應(yīng)[5]。CD4+T細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)在BC患者外周血、腫瘤組織及癌旁組織中有何變化，這些變化與BC的臨床病理資料有何關(guān)系，尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于上述原因，本研究通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)BC患者外周血及腫瘤組織、癌旁組織中CD4+T細(xì)胞上Tim-3及PD-1的表達(dá)情況并分析其臨床意義，旨在探討CD4+T細(xì)胞上免疫抑制性受體與BC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，從而為三陰性BC的臨床治療提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年1月至2014年1月入住鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科的三陰性BC患者，連續(xù)入選。所有患者均為初診，術(shù)前未接受過(guò)放化療及其他治療。患者的年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期等臨床資料均被采集。所有患者均由同一位外科醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，標(biāo)本采集均征得患者本人同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集 于手術(shù)前1 d分別收集三陰性BC患者的清晨空腹外周血標(biāo)本兩管，一管用EDTA-Na2抗凝管采集，另一管用促凝管采集。并于標(biāo)本收集后2 h內(nèi)送到鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院生物免疫治療實(shí)驗(yàn)室備用。采用相同方法抽取22例健康供者的外周血2 ml作為健康對(duì)照組。

組織標(biāo)本的收集：患者簽署知情同意書(shū)后，于術(shù)中將切下的腫瘤組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織放到事先準(zhǔn)備好的含有慶大霉素(900 IU/ml)，青霉素(500 IU/ml)和鏈霉素(500 μg/ml)的GTT-551無(wú)血清培養(yǎng)基中，立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.3 腫瘤組織及癌旁組織中單細(xì)胞懸液的分離 分別將腫瘤組織和癌旁組織剪切成1～2 mm3的組織碎塊，分別放入配好的胰蛋白酶混合液中(含膠原酶Ⅰ1 μg/ml，膠原酶Ⅳ1 μg/ml，DNase 25 μg/ml，含2%的胎牛血清)，然后將細(xì)胞放入自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，每30 min觀察1次，根據(jù)組織消化情況終止反應(yīng)(加入胎牛血清，其終濃度為5%)。采用Percoll組織樣本分離液，密度梯度離心分離獲得單細(xì)胞懸液備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)Tim-3和PD-1在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)：取外周抗凝血，腫瘤組織及癌旁組織單細(xì)胞懸液各100 μl，分別吸取熒光標(biāo)記的特異性抗體(抗PD-1-FITC，抗CD4-PerCP-cy5.5，抗Tim-3-PE)各5 μl 加入流式管，混合均勻，置于冰上避光孵育 20 min。同時(shí)設(shè)各通道同型對(duì)照管以調(diào)補(bǔ)償。反應(yīng)后的外周血流式管內(nèi)加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，振蕩混勻，避光放置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min，腫瘤組織及癌旁組織單細(xì)胞懸液管省去此步驟。取FACS緩沖液(含5%牛血清白蛋白和0.09%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液)2 ml，離心，棄上清，用300 μl的FACS緩沖液重懸后，采用FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀(BD Pharmingen)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，應(yīng)用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，記錄陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)用中位數(shù)和范圍描述，外周血中Tim-3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性用Mann-Whitney U test分析；有序變量之間的聯(lián)系用Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)用來(lái)確定變量因子之間相關(guān)的強(qiáng)度。定量資料采用平均數(shù)進(jìn)行描述。腫瘤組織、癌旁組織及外周血中PD-1和Tim-3表達(dá)的差異采用成對(duì)t檢驗(yàn)分析。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入選患者的基本臨床特征 符合入選條件的患者共52例，入選患者的中位年齡為61歲(35～77歲)，22個(gè)年齡、性別與此相匹配的健康人的標(biāo)本作為對(duì)照。入選研究對(duì)象的具體信息見(jiàn)表1。

表1 入選研究對(duì)象的臨床基本資料(n)

2.2 三陰性BC患者與健康人外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1表達(dá)水平的比較 三陰性BC患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平為2.74%(0.83%～27.6%)，PD-1的表達(dá)水平為17.15%(4.1%～45.7%)，分別高于其在健康對(duì)照組外周血中的水平1.7%(0.52%～5.35%)，P=0.026 4(2.74%比1.7%，Tim-3)，11.8%(2.2%～16.9 %)，P=0.000 6(17.15%比11.8%，PD-1)。(圖1 A～C為代表性的流式圖，圖D～E為統(tǒng)計(jì)分析圖)。三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+的表達(dá)水平為2.23%(0.52%～26.6%)，明顯高于其在健康對(duì)照組外周血中的表達(dá)水平1.13%(0.14%～5.52%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 6)(圖1F)。

圖1 三陰性BC患者外周血CD4陽(yáng)性細(xì)胞上Tim-3和PD-1的表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較

2.3 三陰性BC患者腫瘤組織與癌旁組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1的表達(dá)差異 CD4+T細(xì)胞上Tim-3在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)(27.2%比7.8%，P=0.000 6)，CD4+T細(xì)胞上PD-1在腫瘤組織中的表達(dá)亦明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)(44.05%比23.24%，P=0.006 9)，代表性的流式圖見(jiàn)圖2(A～C)，匯總的7個(gè)患者的統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖2(D～E)。進(jìn)一步分析組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3和PD-1的共表達(dá)情況，結(jié)果顯示：CD4+T細(xì)胞上Tim-3+PD-1+在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)(25.43%比7.28%，P=0.002 9)。三陰性BC患者腫瘤組織CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+的表達(dá)明顯高于其在外周血中的表達(dá)(25.43%比5.78%，P=0.003 9，見(jiàn)圖2)。癌旁組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+的表達(dá)與其在外周血中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.28%比5.78%，P=0.052 5)。

圖2 三陰性BC患者癌組織、癌旁組織及其外周血中CD4陽(yáng)性細(xì)胞上Tim-3和PD-1表達(dá)水平的比較

2.4 三陰性BC患者外周血CD4+T細(xì)胞上Tim-3+PD-1+表達(dá)水平與臨床資料的關(guān)系 由于Ⅰ期患者較少，本研究將Ⅰ期和Ⅱ期患者合并，入選的52例患者按照AJCC分期，Ⅰ/Ⅱ期患者共33例，Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者19例，中分化及分化好的患者35例，低分化患者17例。Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中Tim-3+PD-1+細(xì)胞的表達(dá)水平3.23%(0.7%～26.6%)高于Ⅰ/Ⅱ期患者的表達(dá)水平1.66%(0.52%～18.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021 6)。Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中Tim-3+PD-1+細(xì)胞的表達(dá)水平亦明顯高于健康人的水平(3.23%比1.13%，P=0.001 6)，見(jiàn)圖3A。Ⅰ/Ⅱ期三陰性BC患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中Tim-3+PD-1+細(xì)胞的表達(dá)水平稍高于健康人，但與健康人相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.66%比1.13%，P=0.052 4)。中分化及分化好的患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中Tim-3+PD-1+細(xì)胞的表達(dá)水平與低分化患者相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.450 9)。見(jiàn)圖3B。

圖3 三陰性BC患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3 和PD-1表達(dá)水平與臨床資料的關(guān)系

3 討論

T淋巴細(xì)胞在人體細(xì)胞免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活性的免疫調(diào)節(jié)因子(共刺激因子和共抑制因子)之間的相互作用，可以影響機(jī)體的免疫反應(yīng)[6]。CD4+T細(xì)胞不僅可對(duì)CD8+T細(xì)胞的激活和增殖提供“輔助”，還可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，在感染、免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)三陰性BC患者外周血CD4+T細(xì)胞中Tim-3和PD-1的表達(dá)明顯高于健康人，這一研究結(jié)果與以往報(bào)道的在濾泡性淋巴瘤、口腔鱗癌及卵巢癌患者中的研究結(jié)果[8-9]一致。此外，Tim-3的高表達(dá)不僅存在于腫瘤患者體內(nèi)，在一些病毒感染的患者體內(nèi)也存在Tim-3的高表達(dá)。HIV感染患者耗竭的CD4+T細(xì)胞上也高表達(dá)Tim-3，相似的在HCV、HBV感染患者耗竭的T細(xì)胞上也都有Tim-3的表達(dá)[10]。

在慢性HCV感染時(shí)，CD4+和CD8+T細(xì)胞上Tim-3均升高，且大部分細(xì)胞為T(mén)im-3+PD-1+。與慢性病毒感染時(shí)一樣，在小鼠BC和惡性黑色素瘤的腫瘤浸潤(rùn)組織CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞上可見(jiàn)Tim-3和PD-1共表達(dá)[11]。本研究結(jié)果顯示，三陰性BC患者外周血CD4+T細(xì)胞中Tim-3+PD-1+的表達(dá)亦明顯高于健康人，這一結(jié)果與惡性黑色素瘤患者研究結(jié)果一致，提示Tim-3+PD-1+的表達(dá)可能導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞的功能耗竭，可能是CD4+T細(xì)胞參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、促進(jìn)BC疾病進(jìn)展的機(jī)制之一。

三陰性BC患者腫瘤組織中CD4+T淋巴細(xì)胞上Tim-3+PD-1+的表達(dá)明顯高于其在癌旁組織和外周血中的表達(dá)，提示腫瘤微環(huán)境中可能存在誘導(dǎo)Tim-3和PD-1表達(dá)的細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。因此，了解和研究腫瘤組織、癌旁組織中Tim-3和PD-1的表達(dá)及功能可能更能反映腫瘤的發(fā)生發(fā)展情況。Zhu等[12]近期研究了Tim-3+在BC患者CXCL13浸潤(rùn)的CD4輔助細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)，但未分析Tim-3和PD-1在外周血與腫瘤組織中表達(dá)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者PD-1+CD4+的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)[13]。Wang等[14]則分析了Tim-3多態(tài)性與中國(guó)人患BC的易感性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TIM-3上rs10053538可能增加BC的易感性，并促進(jìn)其病情發(fā)展，但并未分析Tim-3與BC臨床分期的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ/Ⅳ期三陰性BC患者外周血CD4+的細(xì)胞中Tim-3+PD-1+細(xì)胞的表達(dá)水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者的水平，也明顯高于健康人的水平，而Ⅰ/Ⅱ期患者的水平與健康人相比無(wú)明顯差別，提示Tim-3+PD-1+CD4+的表達(dá)可能與三陰性BC的病情進(jìn)展和腫瘤負(fù)荷有關(guān)。此外，Tim-3+PD-1+CD4+的表達(dá)水平在晚期腫瘤患者體內(nèi)增高也可能和腫瘤微環(huán)境有關(guān)。Ⅰ/Ⅱ期患者的水平僅輕度升高，但與健康人相比無(wú)明顯差別，這可能與腫瘤發(fā)展初期循環(huán)外周血中腫瘤抗原少，抗原刺激所產(chǎn)生的特異性T細(xì)胞活性較好，抑制性信號(hào)較弱，T細(xì)胞清除異常抗原的功能并沒(méi)有明顯改變。另一方面，這也可能和樣本量少有關(guān)。此外，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，CD4上Tim-3的表達(dá)與三陰性BC的組織分化程度不相關(guān)。

此項(xiàng)研究結(jié)果豐富了人們對(duì)Tim-3和CD4+T細(xì)胞的認(rèn)識(shí)，為臨床醫(yī)師分析腫瘤患者病情，理解三陰性BC的病情進(jìn)展提供了重要參考。為進(jìn)一步深入研究腫瘤組織對(duì)Tim-3和PD-1的影響奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，Tim-3在慢性病毒感染和腫瘤免疫逃逸中的作用及相關(guān)機(jī)制會(huì)逐步得到闡明，進(jìn)而臨床上可以靶向Tim-3治療腫瘤，利用抗Tim-3抗體治療自身免疫病和移植排斥，并不斷為移植免疫排斥、腫瘤靶向治療、腫瘤疫苗的應(yīng)用等,提供新的治療技術(shù)。

[1] Torre L A, Bray F, Siegel R L, et al. Global Cancer Statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[2] Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer Statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

[3] Gros A, Robbins P F, Yao X, et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors[J]. J Clin Invest, 2014, 124(5):2246-2259.

[4] Zhu C, Anderson A C, Kuchroo V K. TIM-3 and its regulatory role in immune responses[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2011, 350:1-15.

[5] Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan J M, et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity[J]. J Exp Med, 2010, 207(10):2187-2194.

[6] Freeman G J, Casasnovas J M, Umetsu D T, et al. TIM genes: a family of cell surface phosphatidylserine receptors that regulate innate and adaptive immunity[J]. Immunol Rev, 2010, 235(1):172-189.[7] Ma C S, Wong N, Rao G, et al. Unique and shared signaling pathways cooperate to regulate the differentiation of human CD4+T cells into distinct effector subsets[J]. J Exp Med, 2016, 213(8):1589-1608.[8] Brower V. Checkpoint blockade immunotherapy for cancer comes of age[J]. J Natl Cancer Inst, 2015, 107(3):djv069.

[9] Rosenberg S A. Raising the bar: the curative potential of human cancer immunotherapy[J]. Sci Transl Med, 2012, 4(127):127.

[10]Kassu A, Marcus R A, D’Souza M B, et al. Regulation of virus-specific CD4+T cell function by multiple costimulatory receptors during chronic HIV infection[J]. J Immunol, 2010, 185(5):3007-3018.

[11]Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan J M, et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity[J]. J Exp Med, 2010, 207(10):2187-2194.

[12]Zhu S, Lin J, Qiao G, et al. Tim-3 identifies exhausted follicular helper T cells in breast cancer patients[J]. Immunobiology, 2016, 221(9):986-993.

[13]韋騰飛, 張軍, 吳豫, 等. CD4+T細(xì)胞表面共抑制分子的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌疾病進(jìn)展的關(guān)系[J]. 中華腫瘤雜志, 2014, 36(6):424-429.

[14]Wang Z, Liu X, Wang X, et al. Polymorphisms in TIM-3 and breast cancer susceptibility in chinese women: A case-control study[J]. Oncotarget, 2016, 7(28):43703-43712.

Expression and clinical significance of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes in three-negative breast cancer patients

Xu Benling, Yuan Peng, Chen Guangyu, Wang Zhenlei, Yuan Long

(TheAffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China)

Objective To detect the expression of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes in three-negative breast cancer (BC) patients and investigate their potential relationship with the progression of BC. Methods Fifty-two patients with three-negative BC in Department of Breast Surgery, the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University from January of 2013 to January of 2014 were enrolled. All the Peripheral blood and 7 cases of tumor and paraneoplastic tissues from surgically treated BC patients were obtained. The expression of Tim-3 and PD-1 on CD4+T lymphocytes were analyzed by flow cytometry. Results The frequencies of Tim-3+cells, PD-1+cells and Tim-3+PD-1+cells among CD4+cells were significantly higher in BC patients than those in the 22 healthy donors (Tim-3: 2.74%vs1.7%,P=0.026 4; PD-1: 17.15%vs11.8%,P=0.000 6; Tim-3+PD-1+: 2.23%vs1.13%,P=0.006 6). Significant difference was observed for the Tim-3+PD-1+CD4+percentage in stage Ⅲ/Ⅳ patients compared to the patients with stage Ⅰ/Ⅱ (3.23%vs1.66%,P=0.021 6) and healthy donors. Compared with the matched paraneoplastic tissue and their counterparts in blood, the percentage of Tim-3+cells, PD-1+cells and Tim-3+PD-1+cells in tumor-infiltrating CD4+T cells were significantly increased in the tumor tissues. Conclusion The frequencies of Tim-3+cells among CD4+cells were significantly increased in BC patients, indicating that Tim-3+PD-1+CD4+T cells may be one of the mechanisms related to immune escape of tumor cells, acceleration of the development of BC.【Key words】 Breast cancer; CD4+T-lymphocytes; T cell exhaust; Tim-3; PD-1

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃重大項(xiàng)目(201401016)；

河南省留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(豫留學(xué)函2015-5號(hào))；

袁龍，E-mail：13673633569@163.com。

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.07.008

2016-09-07)

鄭州市技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)經(jīng)費(fèi)支持項(xiàng)目(153PKJGG061)。