百色?？菸〔≡姆蛛x與鑒定

歐陽秋飛,黃嬌麗,農(nóng)艷豐,李榮峰,馬 博,楊瑞虎,樊虹伶

(百色學院,廣西 百色 533000)

百色?？菸〔≡姆蛛x與鑒定

歐陽秋飛,黃嬌麗,農(nóng)艷豐,李榮峰,馬 博,楊瑞虎,樊虹伶

(百色學院,廣西 百色 533000)

采用組織分離法從百色市隆林縣的?？菸〔∏o部分離獲得2個菌株P(guān)B0102和PS0202；通過對分離菌進行致病性測定、培養(yǎng)性狀觀察、生理生化測定、16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析,將PB0102和PS0202分別鑒定為Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae。

百色市;?？菸?病原菌;分離;鑒定

近年來,百色市以“東蠶西移”戰(zhàn)略為契機,結(jié)合自身實際,大力發(fā)展桑蠶產(chǎn)業(yè),使桑蠶產(chǎn)業(yè)逐步成為繼芒果、甘蔗之后的特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè),是農(nóng)民增收致富的又一重要渠道[1]。百色市作為廣西重要的桑蠶基地,目前有隆林、靖西、凌云、田東、平果、德保、那坡和樂業(yè)等8個縣(市)進行桑蠶生產(chǎn),現(xiàn)共有桑園21617 hm2。?？菸∪麨樯浼毦钥菸?Mulberry bacterial wilt),自2010年以來,該病相繼在廣西中東部賓陽縣、上林縣、象州縣、忻城縣、宜州市、橫縣、融安縣、鹿寨縣和貴港市等縣(市)大面積發(fā)生,給當?shù)厣ＰQ生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。

在2015年百色市桑樹細菌性病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn),隆林縣平班鎮(zhèn)的桑園中也發(fā)現(xiàn)了類似?？菸“Y狀的植株，感病桑樹表現(xiàn)為葉片從葉緣開始失水萎蔫,繼而褐變干枯并向葉面卷曲；隨著病情的加重,葉片自下而上逐漸掉落,致使感病植株呈光桿狀；剝開發(fā)病植株根莖表皮,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)部有褐色條紋產(chǎn)生。為了準確診斷病害,明確病原,本研究對該病的病原進行了分離和致病性測定,并通過培養(yǎng)性狀觀察、生理生化測定、16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析對該病原菌進行了鑒定,旨在為控制該病在百色市的傳播蔓延提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用菌株為2015年在百色隆林縣平班鎮(zhèn)桑園發(fā)現(xiàn)的病桑莖段經(jīng)組織分離、純化后獲得;致病性測定用桂桑優(yōu)12號(購自廣西桑蠶技術(shù)推廣總站)進行;試驗所用培養(yǎng)基為NA和TTC(氯化三苯基四氮唑)[3]。

1.2 病原菌的分離與純化

病原菌的分離采用傳統(tǒng)組織分離法進行[4],方法如下:剪取5 cm左右新鮮的病桑根、莖段,用自來水洗凈后放入75%的乙醇中1 min進行表面消毒,再轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中消毒2 min,繼而用滅菌水漂洗3～4次,用滅菌濾紙吸干水分;將已消毒的根、莖段放入有2 mL滅菌水的培養(yǎng)皿中,用滅菌鑷子剝?nèi)ケ砥?再用滅菌剪刀和手術(shù)刀刮取、剪碎木質(zhì)部褐變部位,充分混勻以釋放病原菌;最后直接用接種環(huán)沾取一環(huán)分離液于TTC平板上劃線,做好標記,放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。對長出的菌落進行2次重新劃線純化后,再將分離菌劃線于NA斜面培養(yǎng)基中,在30 ℃下培養(yǎng)48 h,保存于4 ℃冰箱。

1.3 病原菌的致病性測定

致病性測定參照蒙姣榮等(2014)的菌液浸泡法[2]接種離體桑枝。具體步驟如下:將保存于4 ℃冰箱的分離菌于NA培養(yǎng)基上活化,在30 ℃下培養(yǎng)24 h后再轉(zhuǎn)接1次,再用滅菌的pH 7.0、0.005 mol/L的PBS緩沖液將平板上的菌苔洗下,制成108cfu/mL菌懸液后,分裝于三角瓶中,每瓶150 mL;再將事先剪下的新鮮桑枝插入三角瓶中,每支留頂葉4片左右。每個菌株5個重復,以接種滅菌的0.005 mol/L PBS緩沖液為對照。接種后,用保鮮袋罩住桑枝,置于自然條件下,溫度為24～33 ℃。自接種第2天開始觀察、記錄桑枝發(fā)病情況。試驗結(jié)束后,采用柯赫氏法則重新分離病原菌,并與原接種菌進行對比。

1.4 病原菌生理生化指標測定

病原菌生理生化指標測定采用購自杭州天和微生物試劑有限公司的細菌微量生化反應(yīng)管。測試項目有:V-P試驗、M-R試驗、葡萄糖、蔗糖、D-阿拉伯糖醇、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原、蜜二糖、L-果糖、D-山梨醇,每個指標的測定設(shè)3個重復。參照Zhu Bo(2011)[5]和《伯杰細菌鑒定手冊》[6]對病原菌各項生理生化指標鑒定結(jié)果進行分析。

1.5 病原菌16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

使用生工Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA。使用TAKARA MightyAmp?DNA Polymerase Ver.2(R071Q)進行PCR擴增,16S rDNA細菌通用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR目的片段大小為1400 bp,反應(yīng)體系為25 μL,反應(yīng)條件為:98 ℃預變性2 min,98 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s,68 ℃ 延伸2 min,共進行35個循環(huán);68 ℃延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL PCR產(chǎn)物點入1%瓊脂糖凝膠中進行電泳,之后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴增結(jié)果。將PCR擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

測序后所得病原菌DNA序列經(jīng)Blastn同源性搜索后,選取與之同源性最高的序列利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹(NJ),通過1000次重復的bootstrap[7]進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與培養(yǎng)特性

從百色隆林縣平班鎮(zhèn)桑園病桑枝條上分離得到的2株分離菌PB0102和PS0202,在NA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h后,菌落均表現(xiàn)為規(guī)則圓形,濕潤,光滑突起,乳白色至淺黃色;在TTC培養(yǎng)基上,也表現(xiàn)為菌落圓形,濕潤光滑,突起,但顏色從菌落中心開始由乳白色向粉紅至深紅色漸變,無流動性。挑取分離菌進行革蘭氏染色,于光學顯微鏡下觀察,兩者皆為革蘭氏陰性菌,且都為橢圓至短桿狀,無芽孢。

2.2 病原菌的致病性測定

對分離菌PB0102和PS0202進行離體桑枝接種,接種后第4天開始葉片出現(xiàn)變黃、萎蔫癥狀；第5天葉片由葉緣開始出現(xiàn)失水褐化；第6天葉片焦枯向內(nèi)卷曲(圖1)；發(fā)病桑枝隨著病情加重,葉片逐漸枯萎掉落,致使枝條呈光桿狀。對發(fā)病桑枝重新進行病原菌分離,得到的分離菌培養(yǎng)性狀與所接菌株一致,且接種桑枝所表現(xiàn)的病癥與田間病癥相同,表明分離菌PB0102和PS0202為桑枯萎病的致病菌。

A:CK;B:PB0102;C:PS0202。圖1 百色?？菸【鶳B0102和 PS0202接種離體桑枝第6天的癥狀

2.3 病原菌的生理生化特性

參照Zhu Bo和《伯杰細菌鑒定手冊》選擇了12項生理生化鑒定指標對PB0102和PS0202進行測定,并與已知菌株Enterobacterasburiae(ATCC35953T)、Enterobactercloacaesubsp. cloacae(ATCC130477T)和Enterobactercloacaesubsp.dissolvens(LMG2683T)的生理生化反應(yīng)結(jié)果作比較,結(jié)果表明PB0102的生理生化特性與Enterobactercloacae完全一致,PS0202與Enterobacterasburiae完全一致。

2.4 病原菌16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

對2株病原菌進行16S rDNA PCR擴增后,得到1條1400 bp大小的特異性條帶(圖2)；將PCR產(chǎn)物直接測序后得到1200 bp的有效序列；再將所得序列提交至NCBI進行BLAST比對,結(jié)果表明: PB0102與多株Enterobactercloacae的序列的相似性達到99%； PS0202與多株Enterobacterasburiae的序列的相似性達到99%。基于16S rDNA序列分析結(jié)果，選擇已報道的腸桿菌屬8個種的8個菌株與本研究的2株病原菌進行分子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，圖3結(jié)果表明： PB0102與Enterobactercloacae(KP165015.1)聚成一簇； PS0202與Enterobacterasburiae(JF772078.1)聚成一簇；兩者都與腸桿菌屬內(nèi)的其他種存在顯著的遺傳距離。結(jié)合2株病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀及生理生化鑒定結(jié)果,將PB0102鑒定為Enterobactercloacae,將PS0202鑒定為Enterobacterasburiae。

表1 百色?？菸【纳砩瘻y試結(jié)果

注:“+”表示為陽性;“-”表示為陰性;“±”表示邊界值,不能準確判斷;“ND”表示無可用數(shù)據(jù)。

M:1 kb Maker;泳道1:PB0102;泳道2:PS0202。圖2 百色桑枯萎病菌16S rDNA的PCR擴增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

由于腸桿菌種屬間常出現(xiàn)交叉聚類現(xiàn)象,使菌株間的遺傳距離較近,僅利用16S rDNA進行分子鑒定,往往不能鑒定到種[8]。因此病原菌鑒定必須以傳統(tǒng)生理生化實驗結(jié)果為基礎(chǔ),再以分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析來進一步驗證。在本研究中，PB0102和PS0202的12項生理生化指標鑒定結(jié)果分別與Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae的完全一致。再根據(jù)分離菌的致病性測定、培養(yǎng)性狀觀察、16S rDNA分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析,確定PB0102和PS0202分別為Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae。

目前我國已報道能引起桑枯萎病的病原菌有腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)和泛菌屬(Pantoea)的多個種[9-12],而廣西已分離到Enterobactercloacae、Enterobacterasburise、Enterobactermori、Klebsiellaoxytoca，以及未確定種Klebsiellasp.和Enterobactersp.共6種病原菌[2,13]。本研究從百色桑園分離到的病原菌確定為Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae。這是桑枯萎病在百色桑園的首次報道,表明?？菸∫延蓮V西中東部向西北部蔓延。這可能是由于近年來百色大力發(fā)展蠶業(yè),大量引進新品種,調(diào)運苗木而導致廣西其他縣(市)的病原隨之傳入。為了防止該病繼續(xù)擴展蔓延,今后在發(fā)展桑蠶生產(chǎn)時,應(yīng)加強該病的檢驗檢疫力度,嚴格進行產(chǎn)地檢疫,并遵守“自留、自繁、自育、自用”的原則,避免從病區(qū)調(diào)運桑樹苗木[14];同時,應(yīng)建立全面的快速檢測體系,從源頭上遏制該病原菌的進一步傳播。目前朱勃(2010)、Lou M M(2011)和姜星(2012)等已報道了Enterobactermori和Enterobacterspp.的快速分子檢測體系,且都表現(xiàn)出良好的靈敏性[15-17]；但由于?？菸【哂胁≡鄻踊卣?因此檢測體系還應(yīng)包括已報道的其他病原種類。

化學藥劑是防治植物病害最直接最有效的方法。蒙姣榮(2015)等對廣西分離到的6種?？菸【M行平板抑菌試驗,結(jié)果表明,中生菌素、氫氧化銅、春雷·王銅、農(nóng)用鏈霉素和嗅菌腈等對這6種病原菌均有一定的抑菌效果,且對家蠶的毒性均表現(xiàn)為低毒,但同一藥劑對不同病原菌的抑菌效果存在明顯差異[18]。今后,應(yīng)繼續(xù)篩選或研制對?？菸【幸种谱饔玫幕瘜W藥劑,并進行田間小區(qū)試驗以明確其在田間的實際防治效果。

圖3 百色?？菸【?6S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

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(責任編輯:黃榮華)

Isolation and Identification of Pathogens Causing Mulberry Wilt Disease in Baise of Guangxi

OUYANG Qiu-fei, HUANG Jiao-li, NONG Yan-feng, LI Rong-feng,MA Bo, YANG Rui-hu, FAN Hong-ling

(Baise University, Baise 533000, China)

Through the method of tissue isolation, two pathogenic bacterial strains PB0102 and PS0202 were isolated from the stem of wilted mulberry plants in Longlin county, Baise city. By pathogenicity test, cultivation trait observation, common physiological and biochemical test, 16S rDNA sequence determination and phylogenetic analysis of the isolated pathogens, PB0102 and PS0202 were identified asEnterobactercloacaeandEnterobacterasburiae, respectively.

Baise city; Mulberry wilt disease; Pathogen; Isolation; Identification

2017-02-20

百色學院一般科研項目(2014KB04);廣西中青年教師能力提升項目(KY2016YB416);廣西高等學校優(yōu)勢特色專業(yè)群建 設(shè)項目[桂教高教(2015)41號66];百色學院特色研究團隊建設(shè)項目[百院字(2015)148號]。

歐陽秋飛(1988─),女,廣西百色人,講師,碩士研究生,主要從事作物栽培及植物病害防治研究。

S888.711

A

1001-8581(2017)07-0071-04