櫻花新品種白玉吉野組培快繁技術(shù)研究

羅桂杰，金 倩，陳 芬

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800)

櫻花新品種白玉吉野組培快繁技術(shù)研究

羅桂杰，金 倩，陳 芬

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800)

以白玉吉野當(dāng)年生帶腋芽莖段為外植體，進(jìn)行了外植體的滅菌、啟動、增殖和生根培養(yǎng)試驗。試驗結(jié)果表明：外植體滅菌消毒方法為75%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCl2浸泡6 min，成活率達(dá)51.33%；促進(jìn)腋芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA，誘導(dǎo)率為72.65%；適宜的增殖最佳培養(yǎng)基配方：MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，增殖系數(shù)為5.76；誘導(dǎo)生根率最高的培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，生根率達(dá)92.02%。

白玉吉野;組培；快繁技術(shù)

櫻花(Cerasus)隸屬于薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoidea)。全世界共150余種，主要分布于北半球溫帶地區(qū)，多數(shù)種類分布于中國、日本和朝鮮。該植物資源豐富，有著豐富野生資源和栽培種類[1-2]，中國的野生櫻花資源十分豐富，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過日本及相鄰國家，分布范圍很廣，從東北到西南，都有櫻花生長。目前，中國櫻屬植物超過50個種或變種，至今已發(fā)表中國櫻屬植物野生種(變種)雙學(xué)名293個，已處理272個，21個學(xué)名未處理，需進(jìn)一步研究[3]。

隨著櫻花的廣泛應(yīng)用，研究櫻花的快速繁殖技術(shù)顯得尤為重要，傳統(tǒng)的繁殖方法有播種、嫁接等繁殖技術(shù)。觀賞櫻花從1991年開始，中國科學(xué)院武漢植物研究所做了櫻花組織培養(yǎng)方面的研究，并且獲得了正常的組培苗[4]。王文房等在6-BA和NAA兩種激素配比誘導(dǎo)下，對櫻花花柄進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到了最適合櫻花花柄形成愈傷組織的激素濃度配比，結(jié)果表明：在MS培養(yǎng)基中加3.0～4.0 mg/L NAA和1.0～2.0 mg/L 6-BA最適合櫻花花柄形成愈傷組織[5]。白玉吉野原產(chǎn)于日本，其花色為純白色，目前我國多數(shù)景點應(yīng)用中主要以粉色系櫻花品種為主，在園林中特別缺少白色花系的品種。因此近幾年我國從日本引進(jìn)白玉吉野，由于這些品種量少價高，因而難以適應(yīng)市場商品化生產(chǎn)的需求，嚴(yán)重限制了白玉吉野新品種的大面積推廣。組織培養(yǎng)方法繁殖具有繁殖周期短、全年都能進(jìn)行繁殖、繁殖系數(shù)高等特點，筆者以白玉吉野為試材，系統(tǒng)研究了不同激素及不同濃度誘導(dǎo)白玉吉野愈傷及不定芽的發(fā)生，找到影響無菌苗生長發(fā)育的制約因子和最佳的使用濃度，使其快繁技術(shù)進(jìn)一步系統(tǒng)化，為白玉吉野產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供切實可行的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

白玉吉野采自宿豫區(qū)運(yùn)河灣農(nóng)科院櫻花園，白玉吉野當(dāng)年生、健壯無病蟲害的嫩枝中上部位作為外植體，去掉葉片留葉柄。

1.2 培養(yǎng)條件

外植體的腋芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)都在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，基本培養(yǎng)基均加入30 g/L蔗糖、6.0 g/L瓊脂、pH 5.8，培養(yǎng)室溫度控制在25～26 ℃，日光燈光照強(qiáng)度1200 lx左右，光照時間為12 h/d。

1.3 方法

1.3.1 外植體前處理 用洗手刷蘸洗衣粉輕輕刷洗莖段表面及腋芽處，經(jīng)自來水沖洗干凈，再切成2～3 cm的小段，每段至少有一個側(cè)芽，用自來水沖洗一遍。

1.3.2 外植體滅菌消毒 對植物材料進(jìn)行前處理后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺進(jìn)行如下消毒處理:70%乙醇浸泡10 s，然后用0.1% HgCl2加吐溫2滴約0.01 mL浸泡，時間分別3、4、5、6、7、8 min，再用無菌水沖洗5遍。消毒后，將植物材料接種到培養(yǎng)基中，每瓶接1個。

1.3.3 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 采用MS基本培養(yǎng)基，利用不同濃度的BA、IBA設(shè)計試驗，BA的濃度為1.0、1.5、2.0 mg/L，IBA的濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L，共9個組合(表2),定期觀察有無污染情況，接種35 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)及生長情況,找出腋芽誘導(dǎo)效果最佳的配方。

1.3.4 增殖培養(yǎng)基的篩選 采用MS基本培養(yǎng)基，利用不同濃度的BA、NAA設(shè)計試驗，BA的濃度為2.5、3.0、3.5 mg/L，NAA的濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L共9個組合(表3)。選取生長一致、狀況良好、緊密，帶有綠色芽點的愈傷組織進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)與增殖試驗。35 d后統(tǒng)計分化率、增殖系數(shù)，找出最佳增殖培養(yǎng)基配方。

1.3.5 生根培養(yǎng)基的篩選 選擇2～3 cm高、生長健壯整齊一致的試管苗先在空白MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d左右，以消除前期激素對生根試驗的影響，然后進(jìn)行生根培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基采用MS，利用不同濃度的BA、NAA設(shè)計試驗，BA的濃度為0.5、1.0、1.5 mg/L，NAA的濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L。35 d后統(tǒng)計無菌苗生根率、平均根數(shù)、平均根長。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌消毒

白玉吉野外植體在快繁中易污染而引起褐變，0.1% HgCl2合理的滅菌時間可達(dá)到較好的滅菌效果。滅菌時間過短，外植體的污染率過高，達(dá)不到滅菌的目的；滅菌時間過長會對外植體造成傷害，從而加重外植體的褐化，影響其成活率。

由表1可以看出，0.1% HgCl2消毒時間3 min時，滅菌不徹底，污染率高達(dá)100%，顯著高于其他各處理，隨著消毒時間增加，污染率逐漸降低；反之，褐化率隨著消毒時間的增加而呈正向相關(guān)，但是消毒時間過長大于6 min時，外置體成活率逐漸降低，褐化死亡率比較高。因此，在消毒時間為6 min時，成活率最高達(dá)51.33%，與其他各處理間差異顯著。由此看來，用0.1% HgCl2消毒6 min是比較理想的消毒方法。

表1 0.1% HgCl2不同消毒時間對 白玉吉野成活率的影響

注：LSD顯著性檢驗，不同字母表示在0.05水平下差異顯著。

2.2 腋芽誘導(dǎo)

表2中數(shù)據(jù)表明，在腋芽誘導(dǎo)的2種因素中，根據(jù)K值的大小，BA的作用最明顯，其次是IBA的影響。因此，兩者對腋芽誘導(dǎo)影響的主次關(guān)系為BA>IBA。

方差分析結(jié)果顯示(表3)，BA的3個水平在影響腋芽誘導(dǎo)方面差異極顯著，隨著BA濃度的升高，誘導(dǎo)率增加。其次是IBA的作用，對腋芽誘導(dǎo)有顯著影響。當(dāng)IBA濃度為0.1 mg/L，腋芽愈傷組織出現(xiàn)較早，在接種12 d后出現(xiàn)愈傷，隨著BA濃度的增加，誘導(dǎo)率隨之增加，但愈傷生長狀況普遍較差，早期顏色偏白色、密度小，后期褐化比較嚴(yán)重，芽點少；當(dāng)IBA濃度為0.3 mg/L時，隨著IBA濃度的增加，誘導(dǎo)率反而下降；IBA的濃度為0.2 mg/L時，隨著BA濃度的增加，誘導(dǎo)率隨之升高，當(dāng)BA濃度為2.0 mg/L，誘導(dǎo)率雖然不是最高為72.65%，但愈傷組織生長狀況良好，緊密、淺綠色，隨著培養(yǎng)時間增加，有較多的小芽點。因此，促進(jìn)腋芽愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA。

2.3 無菌苗增殖誘導(dǎo)

極差的大小反映了該因素對指標(biāo)值影響的大小，極差大則該因素對指標(biāo)值的影響大，極差小則該因素對指標(biāo)值的影響小。為比較BA、NAA對不定芽誘導(dǎo)與增殖的影響，對這2個因素進(jìn)行極差分析，極差分析結(jié)果表明，BA、NAA對增殖系數(shù)影響的主次關(guān)系為BA>NAA(表4)。

表2 不同激素濃度配比對腋芽誘導(dǎo)的影響

注：K1、K2、K3分別表示水平1、水平2、水平3的平均指標(biāo)值，RC2表示增殖系數(shù)的極差。

表3 不同激素濃度配比對腋芽誘導(dǎo)影響的方差分析

方差分析結(jié)果顯示(表5)，BA的3個水平在影響組培苗增殖方面差異極顯著。隨著BA濃度的升高，增殖系數(shù)隨之下降，在BA濃度為2.5 mg/L時增殖系數(shù)和分化率都最高，對組培苗增殖培養(yǎng)的效果最佳。其次是NAA的作用，對組培苗增殖有顯著影響，隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)先升高后降低，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時增殖系數(shù)相對比較高。綜上分析，無菌苗增殖最佳培養(yǎng)基配方：MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA。

表4 不同激素對不定芽誘導(dǎo)與增殖的影響

注：K1、K2、K3分別表示水平1、水平2、水平3的平均指標(biāo)值，RC2表示增殖系數(shù)的極差。

2.4 生根誘導(dǎo)

表6中數(shù)據(jù)表明，BA、NAA對生根誘導(dǎo)的影響順序是BA>NAA，這說明，影響生根效果的2個因素中BA的作用最明顯，其次是NAA。由K值的大小可以看出，生根率隨著BA濃度的增加而降低，而NAA對生根率的影響隨著濃度的增加先升高后降低，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時，生根率最高。

表5 不同激素對不定芽誘導(dǎo)與增殖影響的方差分析

由表7方差分析結(jié)果說明，BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg/L 3個水平之間差異極顯著。BA各濃度對組培苗生根的影響為0.5>1.5>2.0 mg/L，這說明0.5 mg/L BA是生根的最佳用量；NAA的濃度分別為0.1、0.2、0.3 mg/L時各濃度對生根影響的順序是0.2>0.1>0.3 mg/L。由方差分析結(jié)果說明(表7)，NAA的3個濃度在誘導(dǎo)組培苗生根方面差異極顯著，NAA濃度為0.2 mg/L時誘導(dǎo)組培苗生根率最高，當(dāng)NAA濃度大于0.2 mg/L時，反而對組培苗的生根有一定程度的抑制作用。由此確定，誘導(dǎo)生根率最高的培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，生根率達(dá)92.02%。

表6 不同激素對組培苗生根的影響

注：K1、K2、K3分別表示水平1、水平2、水平3的平均指標(biāo)值，R表示生根率的極差。

表7 不同激素對組培苗生根影響的方差分析

2.5 煉苗和移栽

當(dāng)瓶苗的根長3～4 cm時，進(jìn)行煉苗移栽。在移栽前，要先將瓶蓋打開適應(yīng)一個星期，然后小心取出苗，不要傷及根系，用自來水沖凈根部培養(yǎng)基。移栽基質(zhì)為黃心土∶蛙石按1∶1混合，栽后澆透水，并噴施800倍液多菌靈，蓋膜保濕，遮陰網(wǎng)遮陰，保持溫度在25 ℃左右，相對濕度80%左右。噴水2～3次/d，3 d后適當(dāng)通風(fēng)，7 d后去掉遮陰網(wǎng)并減少噴水次數(shù)。

3 結(jié)論與討論

3.1 無菌體系的建立

70%乙醇和0.1% HgCl2混合使用作為消毒劑，是由于70%乙醇不能徹底殺菌，一般不能單獨使用，但是70%乙醇的濕潤作用強(qiáng)，可以排除掉材料表面的空氣，有利于其他消毒劑的滲入，因此兩者配合使用[6]。試驗結(jié)果表明，0.1% HgCl2處理時間越短，消毒不徹底，外植體污染率越高；0.1% HgCl2消毒時間過長，雖然污染率降低，但外植體受到傷害，褐化死亡率增加。當(dāng)消毒時間為6 min時，雖然外植體污染率不是最低，還存在一定的污染情況，但是此時腋芽成活率最高，顯著高于其他各處理。因此，兼顧消毒效果及對外植體傷害程度我們篩選出75%乙醇10 s+0.1% HgCl26 min對外植體進(jìn)行滅菌。

3.2 腋芽誘導(dǎo)

在本研究中，BA、IBA均可以提高腋芽培養(yǎng)的誘導(dǎo)率，BA的作用明顯優(yōu)于IBA的影響。當(dāng)BA為2.0 mg/L，IBA為0.1 mg/L時，雖然增殖系數(shù)最高，但愈傷生長狀況普遍較差，能夠用于增殖培養(yǎng)的有效芽數(shù)量少。當(dāng)IBA為0.2 mg/L時，誘導(dǎo)率雖然不是最高，但愈傷組織普遍生長狀況良好，緊密、淺綠色，隨著培養(yǎng)時間增加，有較多的小芽點。此時在培養(yǎng)基中添加BA，隨著BA濃度的升高，啟動率、有效增殖數(shù)均升高。因此，促進(jìn)腋芽愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA。

3.3 增殖誘導(dǎo)

無菌苗的增殖研究是植物組培再生體系建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是植物快速增殖的根本。試驗表明，低濃度的BA有利于腋芽的增殖，當(dāng)其濃度過高時，幼苗呈半透明狀、淺黃綠色、生長緩慢、葉片數(shù)少、玻璃化嚴(yán)重，這與珠美海棠(Maluszumi)[7]、蘆薈(Aloeveravar. chinese)[8]在組織培養(yǎng)中研究的結(jié)果相一致。BA適宜濃度是2.5 mg/L，NAA濃度的變化對苗長勢影響程度不明顯，但對愈傷的影響較大，當(dāng)NAA濃度高于0.2 mg/L時容易導(dǎo)致叢生芽形成大量愈傷組織，隨著NAA濃度的升高，愈傷變得疏松，顏色由黃綠變?yōu)榈S或白色(為無效愈傷)；而低于0.1 mg/L時芽分化少，長勢慢。因此增殖效果最佳組合是BA濃度為2.5 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L，此時可獲得增殖系數(shù)高、生長旺盛的叢生芽，有利于進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)。

3.4 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)是試管苗快速繁殖的基礎(chǔ)，國內(nèi)外學(xué)者對于不同植物組培苗生根的研究做了大量的探索[9-11]。試驗表明，隨著BA濃度增加，試管苗生根的各項指標(biāo)均相應(yīng)降低，綜合生根率、平均根數(shù)和平均根長3項指標(biāo)，0.5 mg/L BA的生根效果最好。當(dāng)BA濃度為0.5 mg/L時，隨NAA含量的增加，生根率、平均根數(shù)和平均根長都是先增加后降低。當(dāng)NAA含量為0.2 mg/L時，試管苗發(fā)根快，長度、粗度適中，并且顏色為黃白色，須根多，植株長勢良好，因此誘導(dǎo)生根率最高的培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA。

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(責(zé)任編輯：曾小軍)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Technique of Oriental Cherry New Variety Baiyujiye

LUO Gui-jie, JIN Qian, CHEN Fen

(Suqian Institute of Agricultural Sciences, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Suqian 223800, China)

The one-year-old stems with axillary buds of oriental cherry new variety Baiyujiye were selected as explants, and the experiments in the sterilization, initiation, proliferation and rooting culture of the explants were carried out. The results showed that the best sterilization procedure for explants was 0.1% HgC12for 6 minutes after 75% alcohol for 30 seconds, and their survival rate could reach 51.33%. The optimal medium for the inducement of axillary bud was MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA, and the inducement rate was 72.65%. The optimum medium for the proliferation was MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA, and the proliferation coefficient was 5.76. The best medium for the rooting was MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA, and the rooting rate reached 92.02%.

Oriental cherry Baiyujiye; Tissue culture; Rapid propagation

2017-02-24

2016年江蘇省宿遷市農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(SQCX2016-03)。

羅桂杰(1981─)女，江蘇宿遷人，助理研究員，碩士，從事林木、果樹、花卉方面的研究。

Q949.751.8

A

1001-8581(2017)07-0044-04