鎖陽對四氯化碳誘導肝纖維化小鼠的防治作用

李珊，張珂，李國玉，王航宇，陳昱林，彭歡，王金輝,2*

（1石河子大學藥學院，新疆 石河子 832002；2沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016）

鎖陽對四氯化碳誘導肝纖維化小鼠的防治作用

李珊1，張珂1，李國玉1，王航宇1，陳昱林1，彭歡1，王金輝1,2*

（1石河子大學藥學院，新疆 石河子 832002；2沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016）

為研究鎖陽對四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠的治療作用。采用將120只昆明小鼠隨機分為6組，正常組、模型組、陽性對照組、鎖陽提取物低、中、高給藥組的方法。用CCl4和橄欖油的混合溶液進行造模，除了正常組，其它5組均腹腔注射10 mL/kg 6%CCl4，每周2次，連續(xù)8周，第5周對陽性對照組（水飛薊賓膠囊0.2 g/kg）和鎖陽給藥組（0.15、0.3、0.6 g/kg）每天進行灌胃，正常組和模型組以同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。測定小鼠血清AST、ALT、LDH、和LN的含量，以及肝組織的SOD、GSH、MDA和Hyp的含量，稱重并計算肝臟及脾臟指數(shù)。結果顯示，與模型組相比較，鎖陽給藥組可明顯降低肝纖維化小鼠血清的AST、ALT、LDH和LN的含量，降低肝纖維化小鼠肝組織的Hyp和MDA的含量，升高SOD和GSH的含量，并降低小鼠的臟器指數(shù)。由此可知，鎖陽對四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠有治療作用。

鎖陽；四氯化碳；肝纖維化

肝纖維化（liver fibrosis）是大多數(shù)慢性肝臟損傷的最終病理結果［1-3］，因細胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）的合成大于降解，導致其在肝臟內(nèi)過度沉積引起。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）已被確定為細胞外基質(zhì)的主要細胞來源，是引發(fā)肝纖維化的重要因素之一［4］，因此HSC的增殖活化是形成肝纖維化的重要環(huán)節(jié)，抑制HSC的增殖活化則有利于治療肝纖維化［2-5］。通過研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝纖維化的形成是一個可逆的過程［6］，在預防、治療和逆轉(zhuǎn)肝纖維化疾病中，中草藥具有不可或缺的優(yōu)勢。目前，已經(jīng)有多種中藥應用于纖維化疾病的治療中，如：丹參、莪術、百合、穿山甲、冬蟲夏草等，能有效的抑制肝組織膠原纖維的增生，改善肝內(nèi)微循環(huán)，發(fā)揮抗肝纖維化的作用，為肝纖維化疾病的治療帶來曙光。

鎖陽是常用的傳統(tǒng)中蒙藥，又稱為鎖嚴子、銹鐵棒、地毛球、瑣陽、不老藥，多寄生在蒺藜科白刺屬植物的根部，主要分布于新疆、青海、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、陜西等荒漠地帶。性甘、溫，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)和大腸經(jīng)，具有補腎壯陽、益腸通便的功效，用于腰膝痿軟，陽痿滑精，腸燥便秘等疾病。其主要含有的化學成分為黃酮類［7］、萜類、甾體類、有機酸類、多糖類［8］、揮發(fā)性成分和鞣質(zhì)等多種活性成分，使其具有抗缺氧、抗衰老、抗氧化［9］、抗疲勞［10］、增強免疫力、清除自由基［11］等作用。有研究報道通過對鎖陽化學成分的研究，發(fā)現(xiàn)鎖陽單體Songarin A對肝損傷細胞模型有干預作用［12］。本文通過采用腹腔注射10 mL/kg 6%CCl4誘導小鼠肝纖維化，來進一步研究鎖陽對小鼠肝纖維化的治療作用，為鎖陽抗肝纖維化的臨床運用、開發(fā)與研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性昆明種小鼠，體重20±2 g，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（新）2011-0001，在飼養(yǎng)一周適應環(huán)境后開始實驗。

1.2 實驗藥物

鎖陽購買于內(nèi)蒙古，由石河子大學藥學院譚勇副教授鑒定為鎖陽Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖。

提取方法：鎖陽12 kg，砸碎后分別用 10倍、8倍、8倍量的60%乙醇提取3次，每次3 h，提取液濃縮得浸膏(4.078 kg)。

60%乙醇鎖陽浸膏低劑量給藥組：稱取6 g的鎖陽浸膏，加200 mL的雙蒸水，配制成30 mg/mL的給藥組，每只小鼠的給藥量為0.15 g/kg。

60%乙醇鎖陽浸膏中劑量給藥組：稱取12 g的鎖陽浸膏，加200 mL的雙蒸水，配制成60 mg/mL的給藥組，每只小鼠的給藥量為0.3 g/kg。

60%乙醇鎖陽浸膏高劑量給藥組：稱取24 g的鎖陽浸膏，加200 mL的雙蒸水，配制成120 mg/mL的給藥組，每只小鼠的給藥量為0.6 g/kg。

水飛薊賓膠囊陽性藥對照組：稱取4 g的水飛薊賓膠囊，加200 mL的雙蒸水，配制成20 mg/mL的給藥組，每只小鼠的給藥量為0.2 g/kg。

1.3 試劑

CCl4（分析純，天津市富宇精細化工有限公司，批號20141108），水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號：20161012），橄欖油為市售，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）（批號：20161227）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）（批號：20161228）、乳酸脫氫酶 （LDH）（批號：20161221）、層粘連蛋白（LN）（批號：20161227）、丙二醛（MDA）（批號：20161227）、超氧化物歧化酶（SOD）（批 號 ：20161226）、 羥 脯 氨 酸 （Hyp）（批 號 ：20161225）、微量還原型谷胱甘肽（GSH）（批號：20161226），測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio）（批號：20151226）購于北京索萊寶科技有限公司。

1.4 儀器

全自動多功能酶標儀（Therrno 3001，美國Thermo公司），UV-2600型紫外分光光度計（日本島津公司），DHP-9162型電熱恒溫（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），DHP-9126電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 肝纖維化模型的建立與給藥

將雄性昆明小鼠喂養(yǎng)一周適應環(huán)境后，隨機分為6組（正常組、模型組、陽性對照組、鎖陽給藥低、中、高組），每組20只。除了正常組，其它5組均腹腔注射10 mL/kg 6%CCl4，每周2次，連續(xù)8周。于造模第5周對陽性對照組（水飛薊賓膠囊 0.2 g/kg）和鎖陽給藥組（0.15、0.3、0.6 g/kg）每天進行灌胃，正常組和模型組以同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。實驗期間，所有小鼠定量喂食，自由飲水。每星期在喂食給藥前對小鼠進行稱重記錄，并觀察和記錄小鼠毛色和行為活動。

1.5.2 取材

于第8周末次給藥后，禁食24 h，摘眼球取血，常溫靜置1 h后3500 r/min離心10 min，取血清，保存于-20℃冰箱冷凍，用于血清指標的測定。采血后解剖小鼠，取肝臟、脾臟稱重，計算臟器指數(shù)，然后將肝組織保存于-20℃冰箱用于肝組織測定指標。

肝組織標本：用生理鹽水對小鼠的肝臟進行灌流，然后取出肝臟，放入10%的甲醛溶液中固定，用于HE染色。

1.6 指標的測定

1.6.1 用血清測定AST、ALT、LDH和LN含量，按試劑盒說明書操作，使用酶標儀進行測定

1.6.2 制備10%的肝組織勻漿液

稱取肝組織，按重量（g）:體積（mL）=1∶9 的比例加入9倍體積的生理鹽水，剪碎組織，冰水浴勻漿，3000 r/min，離心 10 min，取上清液，用于測定 TP、GSH、SOD、MDA和 Hyp的含量。

1.6.3 臟器指數(shù)

稱取肝臟和脾臟的重量，計算臟器指數(shù)肝（脾）臟指數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體重×100%。

1.6.4 病理組織學觀察

石蠟包埋，切片，HE染色觀察肝纖維化小鼠的病理組織學變化。

1.6.5 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行處理，實驗結果以±S表示。使用one-way ANOVA比較組間差異。當P＜0.05時有顯著性差異（具有統(tǒng)計學意義），當P＜0.01時有極顯著性差異（具有統(tǒng)計學意義）。

2 結果

2.1 對肝纖維化小鼠臟器指數(shù)的影響

與正常組相比，模型組的肝臟指數(shù)明顯升高（P＜0.01），鎖陽低劑量和中劑量給藥組的肝臟指數(shù)與模型組相比無顯著性差異（P＞0.05），鎖陽高劑量組和水飛薊賓膠囊對照組的肝臟指數(shù)與模型組相比明顯降低（P＜0.01）。與正常組相比，模型組的脾臟指數(shù)明顯升高（P＜0.01），鎖陽低劑量給藥組與模型組相比無顯著性差異（P＞0.05），鎖陽中劑量組、高劑量組和水飛薊賓膠囊對照組的脾臟指數(shù)與模型組相比明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）（表 1）。

表1 鎖陽對肝纖維化小鼠臟器指數(shù)的影響Tab.1 Effect of Cynomorium Songaricum on organ indexes of hepatic fibrosis mice

2.2 對肝功能指標AST、ALT、LDH的影響

與正常組相比，模型組的AST、ALT、LDH含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，鎖陽給藥組和水飛薊賓膠囊對照組 AST、ALT、LDH含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），且鎖陽給藥組的療效與給藥劑量成正比關系（表2）。

表2 鎖陽對肝功能指標AST、ALT、LDH的影響Tab.2 Effect of Cynomorium Songaricum on AST、ALT、LDH activities of Hepatic function index

2.3 對肝纖維化指標LN的影響

與正常組相比，模型組的LN含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，鎖陽給藥組和水飛薊賓膠囊對照組LN含量明顯降低（P＜0.01），且鎖陽給藥組的療效與給藥劑量成正比關系（圖1）。

圖1 鎖陽對肝纖維化指標LN的影響Fig.1 Effect of Cynomorium Songaricum on LN activities of Hepatic fibrosis index

2.4 對肝組織Hyp的影響

與正常組相比，模型組Hyp的含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，鎖陽給藥組和水飛薊賓膠囊對照組Hyp含量明顯降低（P＜0.01），且鎖陽給藥組的療效與給藥劑量成正比關系（圖2）。

圖2 鎖陽對肝組織Hyp的影響Fig.2 Effect of Cynomorium songaricum on Hypactivities in hepatic tissue

2.5 對肝組織抗氧化物酶和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 SOD、GSH、MDA的影響

與正常組相比，模型組MDA的含量明顯升高（P＜0.01），SOD、GSH 活性明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，鎖陽給藥組和水飛薊賓膠囊對照組MDA含量明顯降低 （P＜0.05，P＜0.01），SOD、GSH 活性明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），且鎖陽給藥組的療效與給藥劑量成正比關系（表3）。

表3 鎖陽對肝組織SOD、GSH和MDA的影響Tab.3 Effect of Cynomorium Songaricum on SOD、GSH、MDA activities in hepatic tissue

2.6 對肝臟病理組織學的影響

HE染色結果顯示，正常組肝組織結構清晰，肝小葉完整，肝細胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區(qū)僅有少量的纖維組織。模型組部分肝小葉結構紊亂，有大量炎癥細胞浸潤，并有假小葉形成，肝細胞普遍壞死，膠原纖維大量增生并形成纖維間隔。水飛薊賓膠囊對照組肝纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，肝細胞索排列基本整齊，未見明顯的纖維間隔形成，肝細胞壞死減少，炎癥減輕，僅在匯管區(qū)看到少量纖維組織增生。鎖陽低、中、高給藥組與模型組相比，肝纖維化的現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)，匯管區(qū)膠原纖維增生減少，纖維間隔變窄，肝細胞壞死程度減輕，炎癥細胞浸潤減少，且肝纖維化程度隨給藥劑量的增加而減輕（圖3）。

圖3 鎖陽對肝纖維化小鼠肝臟病理組織學的影響（HE，×100）Fig.3 Effect of Cynomorium Songaricum on liver pathological histology in hepatic fibrosis mice（HE，×100）

3 結果與討論

肝纖維化的本質(zhì)是多種致病因素引起的肝損傷刺激傷口的愈合反應［13］，是ECM的合成與降解失衡，導致ECM在肝臟內(nèi)過度沉積的結果［14-15］。ECM的大量沉積，引起膠原纖維增生，導致肝功能減退，形成肝硬化。肝纖維化的形成是一個復雜的過程，了解肝纖維化的形成機制，有助于預防和治療肝纖維化。肝纖維化嚴重影響人們的健康和生活，尋找快速有效的手段治療和逆轉(zhuǎn)肝纖維化十分關鍵。

AST、ALT、LDH主要存在于肝細胞漿內(nèi)，肝纖維化時，肝細胞受損壞死，細胞膜的通透性增加，從而使血清中AST、ALT、LDH的含量增加。實驗結果顯示，與CCl4誘導的模型組相比，鎖陽給藥組可降低小鼠血清中 AST、ALT、LDH的含量，從而保護肝細胞膜的功能并減少炎癥細胞的浸潤。LN是主要存在于基底膜透明層中的非膠原糖蛋白，是細胞外基質(zhì)重要組成部分，肝纖維化時其含量增加，且參與引起肝竇毛細血管化，可反映匯管區(qū)纖維化程度及肝竇毛細血管化的情況，主要用于評價肝纖維化的嚴重程度。鎖陽給藥組與模型組比較，可明顯減少血清中LN的含量，從而減輕小鼠肝纖維化的程度。

膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，而Hyp是構成膠原組織的主要成分，是衡量機體膠原代謝及纖維化的重要指標。MDA是脂質(zhì)過氧化物之一，研究證實MDA可促使膠原的形成，影響膠原組織的代謝從而阻礙肝功能，主要用于反映機體脂質(zhì)過氧化程度，亦可反映機體肝臟受損情況。SOD、GSH可以清除機體過多的脂質(zhì)過氧化物，其含量的高低反映機體的抗氧化物水平和清除自由基的能力。鎖陽給藥組與模型組相比，可明顯降低小鼠肝組織中Hyp及MDA的含量，升高SOD、GSH的含量，減少膠原纖維的形成，增強機體抗氧化水平，清除自由基及脂質(zhì)過氧化物的能力，從而減輕小鼠肝纖維化程度。

與CCl4誘導的模型組相比，鎖陽給藥組還可降低小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)，減輕臟器的腫脹及脂質(zhì)化程度。HE染色顯示鎖陽可明顯改善小鼠肝纖維化程度，減少肝細胞壞死及炎癥細胞的浸潤，抑制膠原纖維的增生。

實驗證明鎖陽具有抗肝纖維化的作用，且治療效果可能與提高機體抗氧化水平及清除自由基能力，并減少膠原纖維的產(chǎn)生，降低細胞外基質(zhì)的沉積有關，但其作用的具體有效成分待進一步的探討與研究。

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The preventive effect of Cynomorium Songaricum on carbon tetrachloride induced liver fibrosis in mice

Li Shan1,Zhang Ke1,Li Guoyu1,Wang Hangyu1,Chen Yulin1,Peng Huan1,Wang Jinhui2*
(1 School of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 School of Traditional Chinese Materia Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang,Liaonin 110016,China)

To investigate the Cynomorium Songaricum treatment of liver fibrosis in mice induced by carbon tetrachloride(CCl4).120 male Kunming mice were randomly divided into 6 groups:the normal group,model group,positive control group,the low,middle and high dose Cynomorium Songaricum group.Models were built by intraperitoneal injection of 6%carbon tetrachloride(CCl4,10 mL),with olive oil,twice a week for eight weeks.From the 5th week,the positive control group was intragastric administrated with 0.2 g/kg Shuifeijibin capsule;and the Cynomorium Songaricum medicine groups were intragastric administrated with 0.15 g/kg,0.3 g/kg,0.6 g/kg corresponding drugs;the normal group and model group with same volume of normal saline lavage,for four weeks.Mice serum AST,ALT,LDH and LN,as well as the liver tissue SOD,GSH,MDA and Hyp were tested,and the liver and spleen index was calculated.Compared with model group,the level of AST,ALT,LDH,LN,the level of Hyp and MDA content and the organ index in Cynomorium Songaricum medicine groups were obviously reduced, while,the SOD and GSH content was increased.It is concluded that Cynomorium Songaricum has a therapeutic effect to the liver fibrosis induced by CCl4in mice.

Cynomorium Songaricum;Carbon tetrachloride;Liver fibrosis

R285.5

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.017

1007-7383(2017)03-0368-05

2017-02-25

國家科技支撐計劃項目（2012BAI30B02），國家自然科學基金項目（81560566）

李珊（1991-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為藥理學。

*通信作者：王金輝（1972-），男，教授，從事藥理學研究，e-mail:15999290001@163.com。