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    蘿卜葉不同萃取物對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性研究

    2017-07-10 01:42:10王樂黃明遠(yuǎn)高品一劉學(xué)貴
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:水相

    王樂 黃明遠(yuǎn) 高品一 劉學(xué)貴

    摘要 [目的]研究蘿卜葉不同萃取組分對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性。[方法]通過對(duì)蘿卜葉水提原液、水提不同萃取組分及萃取后的水相進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性測試,對(duì)蘿卜葉抑制乙酰膽堿酯酶能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]以石杉?jí)A甲為對(duì)照,蘿卜葉不同萃取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制能力從大到小依次為石杉?jí)A甲、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。[結(jié)論]蘿卜葉具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

    關(guān)鍵詞 不同萃取組分;乙酰膽堿酯酶;抑制活性;蘿卜葉水提原液;水相

    中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2017)01-0120-02

    Study of Inhibitory Activity of Different Extracts from Radish Leaves to Acetylcholinesterase

    WANG Le, HUANG Mingyuan, GAO Pinyi, LIU Xuegui*

    (College of Pharmaceutical and Biological Engineering, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang, Liaoning 110142)

    Abstract [Objective] To study inhibitory activity of different extraction fractions from radish leaves to acetylcholinesterase. [Method] The inhibitory activities of different polarities of water extracts from radish leaves to acetylcholinesterase were determined and the ability of radish leaves inhibiting acetylcholinesterase was evaluated. [Result] Using huperzine as the control, the order of inhibiting ability from strong to weak is huperzine, dichloromethane layer, ethyl acetate layer, petroleum ether layer, butanol layer, waterphase, radish leaf extract . [Conclusion] Radish leaves have a good inhibitory activity to acetylcholinesterase and present a concentrationdependent manner.

    Key words Different extraction fractions;Acetylcholinesterase;Inhibitory activity;Radish leaf extract;Waterphase

    蘿卜(Raphanus sativus L.)古漢語中又稱萊菔、雹突、菜頭等,始載于《唐本草》,是生活中常見的蔬菜,為十字花科蘿卜屬1~2年生草本植物[1]。蘿卜根部為主要的食用部位;蘿卜葉又名萊菔葉、蘿卜纓,其纓葉性味甘苦平,主要功能消食理氣[2]?;瘜W(xué)分析證明,蘿卜葉的主要成分是精油和多種維生素,還含微量元素和抗病毒成分[1-2]。

    在生物體內(nèi),乙酰膽堿酯酶(AChE)是以一種蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)的生物催化劑,在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用,能降解乙酰膽堿,使得神經(jīng)遞質(zhì)在突觸后膜上失去活性,從而保證信號(hào)的正常傳導(dǎo)。AChE在體內(nèi)一般有6種不同的分子形式,包括3種球形與3種膠原尾樣亞基連接形成的不對(duì)稱形式,其主要在肝臟中合成,AChE在人體的紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、肝細(xì)胞甚至在骨細(xì)胞中廣泛表達(dá)[3]。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)一般是從天然產(chǎn)物中提取出來的,主要為生物堿類、萜類、酚類等[4]。在天然產(chǎn)物中分離提取AChEI目前已經(jīng)成為醫(yī)藥研究的重點(diǎn)[3-6]。筆者通過對(duì)蘿卜葉水提原液、水提不同萃取成分及萃取后的水相進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性研究,旨在為發(fā)現(xiàn)天然乙酰膽堿酯酶抑制劑提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 研究對(duì)象。

    白蘿卜葉產(chǎn)于遼寧省沈陽市,經(jīng)鑒定為蘿卜的葉子。

    1.1.2 主要儀器。

    電子天平TD5102(余姚市金諾天平儀器有限公司),ZF-20D暗箱式紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),Biotek Synergy2多功能酶標(biāo)儀(基因有限公司),薄層色譜展開缸(上海信宜儀器廠制造),HZC 超聲波清洗器(福州志科學(xué)儀器公司),UV-3200PC紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司),RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮有限公司)。

    1.1.3 主要試劑。

    二甲基亞砜(DMSO,博迪化工股份有限公司),乙酰膽堿酯酶(AChE,北京索萊寶科技公司),PBS粉末(北京索萊寶科技公司),石杉?jí)A甲對(duì)照品(北京索萊寶科技公司),二硫二硝基苯甲酸(DTNB,北京索萊寶科技公司),碘代硫代乙酰膽堿(ATCI,北京索萊寶科技公司),其他化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 蘿卜葉不同萃取組分的制備。

    將4 kg干燥的蘿卜葉放在恒溫水浴鍋中,設(shè)置溫度為20 ℃,加8 L蒸餾水,浸泡水解18 h;提取3次,減壓濃縮,得到濃縮液4 000 mL。取1 000 mL濃縮液,分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇1 000 mL萃取3次,萃取完畢,旋蒸,揮干,制得4個(gè)不同極性萃取組分的浸膏,待用[5]。

    1.2.2 樣品溶液的配制。

    將蘿卜葉中不同萃取組分加入不同劑量的0.1% PBS-DMSO溶液分別配制成濃度為2、100、400、800 μg/mL的樣品儲(chǔ)備液,待用。

    1.2.3 其他溶液的配制。

    1.2.3.1

    PBS緩沖液的配制。

    將PBS粉末通過定容配制成pH 7.4、0.1 mol/L的PBS緩沖液。

    1.2.3.2

    P-D溶液的配制。

    量取10 μL二甲基亞砜至15 mL的EP管中,加入9.99 mL PBS緩沖液,配制成P-D溶液。

    1.2.3.3

    DTNB的配制。

    稱取40 mg DTNB加入無水乙醇將其配制成10 mmol/L的溶液,將溶液保存在4 ℃環(huán)境中。

    1.2.3.4

    底物ATCI的配制。

    準(zhǔn)確稱取43 mg ATCI加入無水乙醇將其配制成15 mmol/L的ATCI溶液。

    1.2.4 活性測試試驗(yàn)。

    1.2.4.1 原理。

    由于碘代硫代乙酰膽堿在AChE的作用下能夠分解生成碘代硫代膽堿,碘代硫代膽堿與顯色劑(DTNB)反應(yīng)生成5-巰基-2-硝基苯甲酸,而生成的5-巰基-2-硝基苯甲酸能夠在405 nm下具有紫外光吸收的黃色物質(zhì)[5],反應(yīng)原理方程式見圖1。

    1.2.4.2 步驟。

    主要采用改良的酶標(biāo)儀法(Ellman法[6])對(duì)蘿卜葉不同萃取組分進(jìn)行測試,步驟主要在于樣品組、樣品本底組以及對(duì)照組之間通過檢測其吸光度值來觀察乙酰膽堿酯酶抑制活性。

    樣品組:在96孔酶標(biāo)板上中依次加入140 μL 0.1 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液、20 μL樣品溶液、15 μL 0.4 U/mL AChE,在4 ℃條件下反應(yīng)20 min。加入10 μL 15 mmol/L底物ATCI,再加入20 μL 10 mmol/L DTNB,在37 ℃條件下反應(yīng)30 min,用酶標(biāo)儀在405 nm處測定其吸光度值,每組試驗(yàn)做3次平行試驗(yàn)。

    樣品本底組:用15 μL PBS緩沖液代替15 μL AChE溶液,其他條件不變。

    空白對(duì)照組:用20 μL PBS緩沖液代替20 μL樣品溶液,其他條件不變。

    完全抑制對(duì)照組:用20 μL PBS緩沖液配制石杉?jí)A甲溶液(0.1 mg/mL)。

    抑制率=[(空白組-完全抑制組)-(樣品組-樣品本底組)]/(空白組-完全抑制組)×100%,各組值均為吸光度值。

    2 結(jié)果與分析

    蘿卜葉經(jīng)過水提取以及石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取,得到石油醚組分、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、正丁醇組分、蘿卜葉水提原液、水相和石杉?jí)A甲7個(gè)樣品溶液。對(duì)這7個(gè)樣品分別進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測[7]。

    由圖2可見,蘿卜葉不同萃取組分樣品均表現(xiàn)出一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性,且其乙酰膽堿酯酶抑制活性與其樣

    品濃度均表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。在樣品濃度梯度較

    低時(shí),抑制率隨著濃度增加近似為線性關(guān)系, 而濃度較大時(shí)抑制率趨于穩(wěn)定。其中二氯甲烷組分具有相對(duì)最強(qiáng)的AChE抑制活性,對(duì)其相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得其IC50為344.02 μg/mL。 乙酸乙酯及石油醚組分對(duì)AChE也表現(xiàn)出較好的抑制活性,且呈明顯的線性相關(guān), IC50分別為369.27、371.12 μg/mL。正丁醇組分的AChE活性相對(duì)較弱。蘿卜葉水提取原液及水相的AChE抑制效果不佳。

    根據(jù)7個(gè)樣品的抑制曲線,確定各樣品的IC50值(表1)。結(jié)合圖2和表1可以確定,7個(gè)樣品的抑制能力從大到小依次為石杉?jí)A甲、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。但參考陽性對(duì)照石杉?jí)A甲,發(fā)現(xiàn)蘿卜葉水提取物各萃取組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性相對(duì)偏低。

    3 結(jié)論

    對(duì)蘿卜葉中不同萃取組分及其AChE抑制活性進(jìn)行研究,以石杉?jí)A甲為對(duì)照品,對(duì)蘿卜葉中6個(gè)不同萃取組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明,6個(gè)組分樣品均表現(xiàn)出一定的AChE抑制活性,其AChE抑制活性與其樣品濃度均表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。由6個(gè)不同萃取組分樣品的IC50值可知,其抑制AChE的活性從大到小為二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。由此可見,蘿卜葉具有較好的AChE抑制活性,同時(shí)為蘿卜葉中AChE抑制活性成分的跟蹤分離提供試驗(yàn)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 汪隆植,何啟偉.中國蘿卜[M].北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2005:1-6.

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    [3] 張明,李盾,陳儀本,等.乙酰膽堿酯酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥,2006,45(1):8-11.

    [4] 楊建紅,陶媛媛,張?jiān)泼?,?藥用植物中乙酰膽堿酯酶抑制劑研究進(jìn)展[J].云南化工,2006,33(6):78-82.

    [5] 張翼,馮妍,李曉明,等.海藻組分抑制乙酰膽堿酯酶活性研究[J].海洋與湖沼,2005,36(5):459-464.

    [6] ELLMAN G L,COURTNEY K D,ANDRES V,Jr,et al.A new and rapid colorimeteric determination of acetylcholinesterase activity[J].Biochem Pharmacol,1961,7(2):88-95.

    [7] 殷帥文,劉麗萍,王安萍,等.17種植物不同溶劑萃取物乙酰膽堿酯酶抑制活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(10):293-296.

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