蔗糖濃度對(duì)滲透休克法提取細(xì)胞周質(zhì)重組蛋白的影響

郭建華

摘要 [目的]研究不同蔗糖濃度的高滲液對(duì)滲透休克法（Osmotic Shock）提取細(xì)胞周質(zhì)蛋白的影響。[方法]將已經(jīng)構(gòu)建好的含F(xiàn)bpA基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到EC感受態(tài)細(xì)胞中，分別在20%、30%、40%和50%的蔗糖高滲液條件下用Osmotic Shock純化蛋白，SDS-PAGE電泳檢測蛋白。[結(jié)果] 30%和40%的蔗糖高滲液能得到濃度更高的重組蛋白，而用20%和50%的蔗糖高滲液提取蛋白產(chǎn)量較低。[結(jié)論]30%和40%的蔗糖高滲液能提高Osmotic Shock法提取細(xì)胞周質(zhì)重組蛋白產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞 蔗糖；滲透休克；細(xì)胞周質(zhì)；重組蛋白

中圖分類號(hào) S188+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）04-0147-02

Effect of Sucrose Concentration on Periplasm Recombination Protein Extracted by Osmotic Shock

GUO Jian-hua（Department of Veterinary Medicine， Rongchang Campus， Southwest University， Chongqing 402460）

Abstract [Objective]To study the effect of hypertonic solutions with different sucrose concentrations on periplasm protein extracted by Osmotic Shock method. [Method]The constructed vector with FbpA gene was transformed to EC competent cell. The recombination proteins were extracted by Osmotic Shock method with 20%， 30%， 40% and 50% sucrose respectively.The protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis.[Result]The result showed that using 30%and 40% sucrose hypertonic solutions could receive more recombination proteins， while 20% and 50% sucrose solutions received fewer protein.[Conclusion]30%and 40% sucrose hypertonic solutions could increase the production of periplasm recombination protein extracted by Osmotic Shock.

Key words Sucrose；Osmotic Shock；Periplasm；Recombination protein

由于大腸桿菌遺傳背景清楚，操作簡單，便于進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)等，因此常用于表達(dá)基因工程的重組蛋白，其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)的應(yīng)用非常廣泛，但目標(biāo)重組蛋白的提取、純化往往耗時(shí)費(fèi)力，產(chǎn)量低且成本高昂，有時(shí)需要用到專業(yè)、昂貴的儀器和設(shè)備，如細(xì)胞破碎儀、親和層析柱等，或者需要用到昂貴的試劑，如Nickel等，其操作繁瑣，蛋白產(chǎn)量也受影響[1]。

細(xì)胞周質(zhì)（Periplasm）是位于革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)膜和外膜之間的結(jié)構(gòu)，其氧化環(huán)境有利于蛋白的折疊，所以其蛋白純化也比較簡單。研究表明，用滲透休克法（Osmotic Shock）可以比較簡單地提取位于細(xì)胞周質(zhì)中的蛋白。Osmotic Shock純化蛋白的原理是首先利用高濃度蔗糖溶液造成高滲透壓讓細(xì)胞收縮，然后用低濃度的硫酸鎂處理細(xì)胞，可以誘導(dǎo)在細(xì)胞周質(zhì)的蛋白釋放，其成本低廉，操作簡單快速，為基因工程中蛋白純化提供了一條新思路。文獻(xiàn)多報(bào)道所使用的蔗糖濃度是20%，但不是所有的蛋白在20%的蔗糖濃度下都可以得到高質(zhì)量的重組蛋白。鐵結(jié)合蛋白（Ferric-binding protein，F(xiàn)bpA）是位于革蘭氏陰性菌細(xì)胞周質(zhì)中、與鐵代謝密切相關(guān)的蛋白，其分子量在37 ku左右[2-3]。該研究利用已經(jīng)構(gòu)建的帶有FbpA蛋白的T7啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到EC感受態(tài)細(xì)胞，通過改變不同濃度的蔗糖，研究其對(duì)Osmotic Shock 純化蛋白產(chǎn)量的影響，探索Osmotic Shock 提純蛋白的最佳試驗(yàn)條件，為今后開發(fā)以FbpA蛋白為前導(dǎo)序列引導(dǎo)融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)，進(jìn)而純化蛋白提供資料。

1 材料與方法

1.1 載體與感受態(tài)細(xì)胞

該試驗(yàn)的載體是已經(jīng)構(gòu)建好的T7啟動(dòng)子系統(tǒng)，啟動(dòng)子后面是EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，接著是連續(xù)8個(gè)組氨酸標(biāo)簽，TEV酶水解位點(diǎn)，F(xiàn)bpA基因，Hind III酶切位點(diǎn)，F(xiàn)bpA基因是927個(gè)堿基。表達(dá)產(chǎn)物包括組氨酸標(biāo)簽、TEV酶水解位點(diǎn)以及FbpA基因，約43 ku。質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖1所示。感受態(tài)細(xì)胞是EC大腸桿菌菌株。

1.2 試劑

高滲溶液：將適量蔗糖溶解于pH 8.0 的30 mmol/L Tris溶液中，分別配制成含有20%、30%、40%、50%蔗糖的高滲溶液。

低滲溶液：5 mmol/L MgSO4溶液。

表達(dá)大腸桿菌培養(yǎng)基：轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)基按照參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，該培養(yǎng)基是Studier FW開發(fā)的一種免異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、可自動(dòng)誘導(dǎo)的用于重組蛋白表達(dá)的專用培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化與菌株培養(yǎng)。取實(shí)驗(yàn)室保存的、經(jīng)過純化的高質(zhì)量質(zhì)粒載體2 μL（約500 ng）加到在冰上融化的60 μL的EC感受態(tài)細(xì)胞中，用加樣槍吹打混勻，置于冰上30 min后，42 ℃水浴中熱休克2 min，然后再置于冰上3 min，加入LB液體培養(yǎng)基1 mL，37 ℃搖床中以180 r/min振蕩培養(yǎng)90 min后，加入含有80 mL表達(dá)用培養(yǎng)液的三角瓶中，180 r/min振蕩培養(yǎng)16～24 h。

1.3.2

Osmotic Shock純化蛋白。將80 mL培養(yǎng)物充分混勻，以每管20 mL分裝于50 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，收集菌株，倒去上層培養(yǎng)基，4管分別加入10 mL含有20%、30%、40%和50%蔗糖的高滲溶液，用吸管反復(fù)吹吸菌體，使菌體充分打散，室溫?fù)u晃10 min后，在4 ℃ 中4 000 r/min離心30 min，迅速倒去上清，將離心管倒置于紙巾中，徹底吸干多余的高滲溶液后，迅速加入1.5 mL 5 mmol/L的低滲MgSO4溶液，用吸管反復(fù)吹吸沉淀，打散菌體，然后置于冰上20 min后，4 ℃、4 000 r/min離心30 min，小心吸取上清至1.5 mL離心管中，即為Osmotic Shock蛋白溶液。

1.3.3 電泳與染色。將前面4種蔗糖濃度下提取得到15 μL的蛋白溶液與15 μL蛋白上樣緩沖液混合，上樣SDS-PAGE，160 V電泳60 min，考馬斯亮藍(lán)染色5 min，脫色液洗脫背景，照相分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

從圖2可以看出，各濃度蔗糖高滲液均能提取出蛋白質(zhì)，出現(xiàn)的蛋白分子量在35 ku～48 ku，符合預(yù)期的片段大小。說明FbpA蛋白作為在細(xì)胞周質(zhì)的蛋白，可以通過Osmotic Shock被很好地提取出來。

4種蔗糖濃度下，通過Osmotic Shock均能觀察到重組蛋白，從圖2可以看出，在30%、40%的蔗糖濃度下，蛋白產(chǎn)量最高，而蔗糖濃度為20%時(shí)，蛋白產(chǎn)量偏低，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)50%時(shí)，蛋白產(chǎn)量下降。

3 討論

用大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白可以在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中或者分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，也可以分泌到細(xì)胞外面。在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，常以包涵體（Inclusion bodies）的形式存在，讓蛋白不能正確折疊，且破碎細(xì)胞常用到昂貴的裂解酶或?qū)ｉT的細(xì)胞破碎儀等復(fù)雜設(shè)備。而分泌到細(xì)胞外的蛋白需要很長的前導(dǎo)序列，增加了蛋白表達(dá)的難度。筆者研究了大腸桿菌表達(dá)周質(zhì)蛋白，簡化提取純化步驟，并研究了Osmotic Shock法提取蛋白最佳的蔗糖濃度[5]。

從該研究來看，Osmotic Shock法提取大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)的蛋白，可以得到純度和濃度都較高的重組蛋白，整個(gè)試驗(yàn)流程只需要2～3 h，且不需要昂貴的儀器、設(shè)備和試劑。

從已有的文獻(xiàn)報(bào)道來看，多數(shù)使用的蔗糖濃度是20%。從該研究來看，提高蔗糖濃度可以進(jìn)一步提高產(chǎn)量，但不是對(duì)所有蛋白都如此，因此在用Osmotic Shock法純化蛋白時(shí)，可以對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行蔗糖濃度試驗(yàn)條件的優(yōu)化研究中，對(duì)于由FbpA介導(dǎo)的細(xì)胞周質(zhì)蛋白，可以把Osmotic Shock的蔗糖濃度提高到40%。

Osmotic Shock只適用于細(xì)胞周質(zhì)的蛋白；對(duì)于在細(xì)胞質(zhì)里面的蛋白是不起作用的；對(duì)于細(xì)胞質(zhì)的蛋白，可以用一些細(xì)胞周質(zhì)蛋白的前導(dǎo)序列，幫助細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)，再用Osmotic Shock方法進(jìn)一步釋放，這樣可以節(jié)約蛋白純化的時(shí)間與成本，提高蛋白的產(chǎn)量[6]。

參考文獻(xiàn)

[1] STEINER D，F(xiàn)ORRER P，STUMPP M T，et al.Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display[J].Nature biotechnology，2006，24（7）：823-831.

[2] FERREIRS C，CRIADO T M，GMEZ J A，et al.The neisserial 37 kDa ferric binding protein（FbpA）[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，1999，123（1）：1-7.

[3] WANG S P，OGATA M，HORITA S，et al.A novel model of ferric ion coordination by the periplasmic ferric ion-binding subunit FbpA of an ABC-type ion transport from Thermus thermophilus HB8[J].Acta Cryst，2012，70（1）：196-202.

[4] STUDIER F W.Protein production by auto-induction in high-density shaking culture[J].Protein Expr Purif，2005，41（1）：207-234.

[5] ZHOU Y Z，LIU P，GAN Y，et al.Enhancing full-length antibody production by signal peptide engineering[J].Microbial cell factories，2016，15：47.

[6] PAAL M，HEEL T，SCHNEIDER R，et al.A novel Ecotin-Ubiquitin-Tag（ECUT）for efficient，soluble peptide production in the periplasm of Escherichia coli[J].Microbial cell factories，2009，8：7-15.