山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展

張艷艷 匡世軍

摘要 對目前現(xiàn)有的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為該技術(shù)在山羊上的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 山羊；子宮內(nèi)膜細(xì)胞；體外培養(yǎng)；應(yīng)用

中圖分類號 S827 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0102-02

Research Progress on the Culture Technologies of Endometrial Cells of Goat in vitro and Their Application

ZHANG Yan-yan1， KUANG Shi-jun2 （1.Department of Pharmaceutical Science and Technology，Heze University， Heze，Shandong 274015； 2. Chongqing Kaizhou Vocational Education Center， Chongqing 405400）

Abstract The research progress on current culture techniques of goat′s endometrial cells in vitro and their applications were reviewed，so as to provide references for further application of this technique in goat.

Key words Goat；Endometrial cells；Culture in vitro；Application

子宮是雌性動物孕育胎兒、繁殖后代的場所，受多種激素的調(diào)節(jié)，同時(shí)也是一個重要的內(nèi)分泌器官，能分泌包括激素、酶類和免疫因子在內(nèi)的多種功能性物質(zhì)。這些物質(zhì)不僅調(diào)節(jié)子宮本身的功能狀態(tài)和生殖平衡，在整個機(jī)體的生理協(xié)調(diào)方面也發(fā)揮著極其重要的作用[1]。子宮內(nèi)膜位于子宮壁最里層的子宮腔面，由上皮層和其下的固有層構(gòu)成；上皮層主要是由具有分泌功能的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞組成，而固有層則主要是由子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞組成；此外，子宮內(nèi)膜還含有少量的表皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和炎性細(xì)胞等[2]。因此，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的培養(yǎng)就是對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)。子宮內(nèi)膜在研究機(jī)體生殖生理方面具有重要地位[3]。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞都是性腺激素的靶細(xì)胞，在雌孕激素的調(diào)節(jié)下發(fā)生一系列變化，為胚胎著床做準(zhǔn)備。這種變化不僅包括細(xì)胞形態(tài)的改變，而且包括細(xì)胞增殖和分泌功能的變化，分泌的各種影響因子能促進(jìn)胚胎著床和維持妊娠[4]。

在體狀態(tài)下研究子宮內(nèi)膜容易受到機(jī)體其他因素的影響，而體外培養(yǎng)細(xì)胞不僅可以排除這些干擾，而且能直接對細(xì)胞進(jìn)行觀察和處理。因此，體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞成為研究子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長分化機(jī)制、雌孕激素對子宮內(nèi)膜的作用機(jī)理以及母體子宮與胚胎之間的相互作用和應(yīng)答反應(yīng)的最佳材料。目前，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)已經(jīng)在人[5]、小鼠[6]、兔[7]、奶牛[8]、牦牛[9]、綿羊[10]、豬[11]、山羊[12-13]等多種動物上獲得成功，其中人和小鼠的相關(guān)研究較多、較成熟，其體外細(xì)胞模型已被廣泛應(yīng)用[14]。此外，還構(gòu)建出永生化的人[15]、綿羊[16]和山羊[17]等子宮內(nèi)膜細(xì)胞。近年來，山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和相關(guān)應(yīng)用不斷取得新成果，為研究山羊生殖生理、內(nèi)分泌和免疫等提供了基本材料和理論基礎(chǔ)。筆者對目前現(xiàn)有的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為該技術(shù)在山羊上的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外分離

體外細(xì)胞的原代培養(yǎng)主要有組織塊貼壁法和消化酶分散法等。其中，用消化酶分散成單細(xì)胞培養(yǎng)是最常用的方法，不僅操作簡單，能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，而且得到的細(xì)胞形態(tài)均一，成功率較高[18]。分離原代細(xì)胞常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶等。胰蛋白酶作用較強(qiáng)，消化速度雖快，但對細(xì)胞損害較大；膠原酶作用溫和，對細(xì)胞損傷小。靳亞平等[19]對2種消化酶消化分解小鼠和山羊子宮內(nèi)膜組織效果的比較也證實(shí)，用膠原酶于37 ℃下消化 4 h，得到的細(xì)胞活率最高。

2 山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的提取與純化子宮內(nèi)膜中主要含有基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。目前，從子宮內(nèi)膜組織消化液中分別提取基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的常用方法有篩網(wǎng)過濾法和自然沉降法。篩網(wǎng)過濾法是利用2種細(xì)胞的體積差異，將細(xì)胞混懸液過200目或400目濾網(wǎng)，使其分離。自然沉降法是利用2種細(xì)胞沉降速度的不同，將細(xì)胞混懸液靜置一段時(shí)間后，上皮細(xì)胞沉降到底部，而基質(zhì)細(xì)胞仍在液體中，從而得以分離。

在山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離純化方面，豐艷妮[12]和吳慶俠等[13]研究表明這2種方法都不能得到高純度的山羊子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞。單純的濾網(wǎng)過濾，仍有大量上皮細(xì)胞留在濾液中，得到的上皮細(xì)胞較少，基質(zhì)細(xì)胞中也混有較多的上皮細(xì)胞，純度低；自然沉降則因?yàn)橄罕容^黏稠，耗時(shí)較長，此外沉淀中還混有未消化完全的組織塊。他們分別首次對山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)，并取得了成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用消化過濾-低速離心-自然沉淀相結(jié)合的方法能一次性分離到純度高于95%的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細(xì)胞。

2.1 消化過濾

將子宮內(nèi)膜剪成1 mm3左右小塊，用D-Hanks液反復(fù)洗滌幾次，直至液體變得清亮，以除去雜質(zhì)細(xì)胞。然后，再將洗凈的組織塊放入三角瓶中，加入適量膠原酶，37 ℃下消化4 h后，用適量含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液混勻，終止消化。將消化后的懸濁液用200目篩網(wǎng)過濾，以去除未消化的組織塊，收集濾過液。

2.2 低速離心-自然沉淀

將過200目篩網(wǎng)的上述濾液，放入離心管中，低速離心，分別收集離心管內(nèi)液體和管底沉淀，分別用于提取子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。

2.2.1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的提純。取上述離心后的管內(nèi)液體，移至新離心管內(nèi)，低速離心，取管內(nèi)細(xì)胞沉淀，用D-Hanks液重新混勻，靜置，待自然沉降一段時(shí)間后收集上部液體，再進(jìn)行低速離心，棄去上層液體，將管底細(xì)胞沉淀用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸后接種培養(yǎng)。24 h后換液，得到純度較高的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞。

2.2.2 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的提純。取過濾網(wǎng)后首次離心的沉淀，加D-Hanks液重懸，低速離心后棄去上層液體，底部沉淀再用D-Hanks液混勻，靜置，使細(xì)胞自然沉降后，收集沉淀，再用D-Hanks液重懸、靜置、沉降。將最后得到的細(xì)胞沉淀加D-Hanks液重懸，離心，棄去上清，管底沉淀用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液混勻，接種培養(yǎng)2～3 d后換液，得到純度較高的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。

3 子宮內(nèi)膜細(xì)胞的鑒定

根據(jù)上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征的差異，進(jìn)行初步鑒定；此外，還需要通過免疫組化染色加以確定。

3.1 細(xì)胞形態(tài)鑒定

新分離的山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞一般為單個分散存在，貼壁較快，一般接種30 min即可貼壁，10 h后就開始生長，3～4 d后鋪滿培養(yǎng)瓶底?；|(zhì)細(xì)胞呈梭形，相互平行并排列成束狀，細(xì)胞胞質(zhì)較稀薄而透明。

剛分離的山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞則呈細(xì)胞團(tuán)塊狀存在，貼壁較慢，接種12 h后才開始貼壁，24 h后細(xì)胞團(tuán)塊外側(cè)的細(xì)胞開始生長，7 d左右才能鋪滿瓶底。上皮細(xì)胞呈鋪路石狀，細(xì)胞間連接緊密，界限清晰，細(xì)胞質(zhì)透明度小。上皮細(xì)胞生長緩慢，傳代較難，2～3代后細(xì)胞就會出現(xiàn)空泡化而逐漸脫落。

3.2 免疫組化染色鑒定

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中含有角蛋白，不含波形蛋白；子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞則含有波形蛋白，不含角蛋白。因此，可分別用角蛋白和波形蛋白作為一抗，對上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色加以區(qū)分。上皮細(xì)胞的染色結(jié)果角蛋白呈陽性、波形蛋白呈陰性，基質(zhì)細(xì)胞的染色結(jié)果則為角蛋白呈陰性、波形蛋白呈陽性。

4 體外培養(yǎng)山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的應(yīng)用

豐艷妮[20]通過將山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與豬外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，用培養(yǎng)過山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞上皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)液，對外周血單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種培養(yǎng)方式都能顯著刺激外周血單核細(xì)胞的增殖，并能抑制植物血球凝集素（PHA-P）對外周血單核細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用。這表明子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可直接影響外周血單核細(xì)胞的活性，參與調(diào)節(jié)子宮免疫平衡。吳慶俠等[21]研究了山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液對山羊外周血單核細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化與分泌活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液可刺激外周血單核細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及IL-2、IL-4的分泌，并抑制PHA-P誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和IL-2分泌，但對PHA-P誘導(dǎo)的IL-4分泌具有促進(jìn)或協(xié)同作用。這表明山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞可能通過旁分泌途徑來影響外周血單核細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與分泌活性，從而調(diào)節(jié)子宮局部免疫調(diào)節(jié)。

由于體外培養(yǎng)的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞較難傳代，特別是上皮細(xì)胞，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞容易出現(xiàn)變異而失去利用價(jià)值，細(xì)胞數(shù)量也難以達(dá)到研究要求。因此，目前對山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的研究主要集中在永生化細(xì)胞系的建立和應(yīng)用上。

吳慶俠等[22]和盛宏霞等[23]分別將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因?qū)朐窖蜃訉m內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中，獲得的陽性克隆細(xì)胞與原代細(xì)胞具有相同的形態(tài)特征與生物學(xué)特性，具有較高的端粒酶活性，并保持了對雌孕激素刺激的正常應(yīng)答反應(yīng)。永生化的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，傳代穩(wěn)定，可為構(gòu)建子宮內(nèi)膜體外模型、研究子宮局部免疫調(diào)節(jié)等提供大量的、表型一致、功能正常的試驗(yàn)材料。南志春等[24]利用永生化的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞證實(shí)基質(zhì)細(xì)胞對上皮細(xì)胞IL-18的分泌活性有調(diào)節(jié)作用。屈延延等[25]研究表明在性腺激素作用下永生化山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞對上皮細(xì)胞的TNF-α與TGF-β分泌活性有重要影響。廖慶紅等[26]研究表明山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞與性腺激素對子宮自然殺傷細(xì)胞（uNK）分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和γ-干擾素（IFN-γ）的活性有不同程度的調(diào)節(jié)作用。

此外，研究者還利用永生化的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為體外模型，對子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病進(jìn)行了研究。白東寧等[27]以永生化山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞作為體外模型，觀察了乳酸菌和一些致病菌對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的黏附特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸菌和致病菌對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞都有很強(qiáng)的黏附性，而乳酸菌對這些病原菌的黏附性有不同程度的拮抗作用，表明永生化山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可作為研究細(xì)菌黏附性的切實(shí)有效的體外材料。鄺曉嬌等[28]利用永生化的山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型，研究丹參水提物對山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型中基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響，結(jié)果表明丹參水提物對內(nèi)毒素引起的子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)有一定的保護(hù)作用。

5 小結(jié)

綜上所述，目前已經(jīng)在體外成功分離到山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞，并構(gòu)建了永生化的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞。利用永生化的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞，研究人員對山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生殖生理功能和子宮內(nèi)膜炎癥機(jī)制進(jìn)行了深入探討。然而，目前對山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的研究仍不夠廣泛和深入。今后對山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的研究可利用永生化的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的生殖生理變化、藥物篩選和子宮內(nèi)膜炎癥機(jī)制等方面進(jìn)行進(jìn)一步探討，從而為山羊子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的研究提供基礎(chǔ)。

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