綿羊母源基因TRIM28克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

羅健，王立民，張譯元，郭延華，唐紅，周平，劉守仁*

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院/綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

綿羊母源基因TRIM28克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

羅健1,2，王立民2，張譯元2，郭延華2，唐紅2，周平2，劉守仁2*

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院/綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

為了研究TRIM28基因在綿羊早期克隆胚胎發(fā)育過程中基因組去甲基化與重新甲基化及其維持的機(jī)制，探索母源關(guān)鍵基因在體細(xì)胞克隆效率中的作用，本研究通過提取中國(guó)美利奴細(xì)毛羊卵巢組織RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增TRIM28基因編碼區(qū)序列，測(cè)序后采用生物信息學(xué)軟件對(duì)編碼區(qū)序列及氨基酸序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，進(jìn)一步采用RT-PCR對(duì)綿羊不同組織中TRIM28表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：克隆獲得了綿羊TRIM28基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)2441 bp，編碼811個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，不同物種TRIM28基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列具有較高保守性。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，TRIM28 mRNA在中國(guó)美利奴細(xì)毛羊肺臟、脾臟和卵巢中高豐度表達(dá)，且與Zfp57表達(dá)情況一致。結(jié)論：TRIM28基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化方面高度保守，推測(cè)其在不同組織中行使轉(zhuǎn)錄中介因子這一特定的生物學(xué)功能相關(guān)，TRIM8與ZFP57復(fù)合體在分化組織中對(duì)基因組甲基化的維持起著重要作用。

TRIM28；Zfp57；母源基因；DNA甲基化；生物信息學(xué)

哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育是由卵母細(xì)胞中儲(chǔ)存的特定RNA和蛋白來調(diào)控，這些因子是在卵子發(fā)生、成熟過程中合成并貯存，即母源基因。受精后，這些母源物質(zhì)指導(dǎo)和支持著早期胚胎發(fā)育，直至合子基因激活，部分母源因子甚至作用時(shí)間更久，所以母源基因表達(dá)模式對(duì)于早期胚胎發(fā)育的重要性已引起學(xué)者們的關(guān)注。母源基因的缺陷可能涉及不孕、流產(chǎn)、胎兒早產(chǎn)以及一些出生缺陷和先天性疾病。因此，闡明母源因子的功能及作用機(jī)制，對(duì)胚胎工程的發(fā)展具有重要作用。2012年Messerschmidt等[1]首次在小鼠上鑒定TRIM28作為母源因子，在植入前早期胚胎發(fā)育過程中對(duì)基因組甲基化印記維持與調(diào)控起著重要作用，母源TRIM28缺失可導(dǎo)致小鼠胚胎死亡，對(duì)早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。

TRIM28（又稱Tif1 β 或 Kap1）是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，最早在1996年作為KRAB-ZFPs結(jié)構(gòu)域的互作中介蛋白被發(fā)現(xiàn)[2]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TRIM家族蛋白超過75個(gè)，在N末端均擁有1個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域——RBCC（RING，B-boxes，coiled-coil）結(jié)構(gòu)。通過這個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域，TRIM28與KRAB-ZFPs結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。RING結(jié)構(gòu)域是由40-60個(gè)氨基酸殘基結(jié)合到鋅原子上形成的特殊鋅指節(jié)構(gòu)，具有激活E3泛素連接酶活性，與其它一些蛋白互作過程中發(fā)揮重要功能[3]。B-boxes結(jié)構(gòu)域是B1和B2 2個(gè)各自由約40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的CH3H2鋅指結(jié)構(gòu)，兩者同時(shí)存在或是只存在B2結(jié)構(gòu)域，其功能未有明確報(bào)道。Coiled-coil結(jié)構(gòu)域是由多個(gè)α-螺旋復(fù)合形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，在同源寡聚過程中起重要作用。與其它TRIM家族蛋白最大的區(qū)別是 TRIM28蛋白 C末端含有 HP1、PHD、BROMO 3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)使得TRIM28能作為骨架蛋白，通過招募異染色質(zhì)蛋白1（HP 1）、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1、組蛋白去乙酰化酶NuRD等染色質(zhì)修飾酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子，共同作用啟動(dòng)異染色質(zhì)形成，以達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄的作用[4-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)TRIM28在哺乳動(dòng)物基因沉默、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖與分化、凋亡、免疫反應(yīng)、腫瘤性轉(zhuǎn)化等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。

目前，TRIM28的研究主要集中在小鼠和人上，而其他動(dòng)物的研究甚少，且綿羊TRIM28 CDS序列尚未見報(bào)。基于此，本研究對(duì)綿羊TRIM28基因 CDS區(qū)序列進(jìn)行了克隆并進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析和相關(guān)的生物信息學(xué)分析，旨在為TRIM28基因在綿羊卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中的分子機(jī)理研究提供前期資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成纖維細(xì)胞采自新疆農(nóng)墾科學(xué)院試驗(yàn)羊場(chǎng)1只2歲中國(guó)美利奴細(xì)毛羊母羊，心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢取自試驗(yàn)羊場(chǎng)3只體型一致、健康狀況良好的18-36月齡中國(guó)美利奴細(xì)毛羊，取出后迅速置于液氮保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

參照Trizol Reagent(Invitrogen)說明書，分別提取中國(guó)美利奴羊各組織總 RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并利用核酸蛋白分析儀測(cè)定 RNA的濃度和純度。采用M-MLV FirstStrandKit（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

1.2.2 綿羊Trim28 cDNA的克隆

根據(jù)牛Trim28 mRNA序列（GenBank登陸號(hào)：BC148899.1）設(shè)計(jì)特異引物，由Invitrogen公司合成，引物序列及相關(guān)信息見表1。PCR擴(kuò)增體系為25 μL， 其 中 5×PrimeSTAR Buffer5 μL、dNTP Mixture 2 μL、上下游引物 （10 μmol/L） 各 0.5 ddH2O 15.75 μL，綿羊卵巢 cDNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、56℃復(fù)性 30 s、72℃延伸 150 s，共 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后將目的片段用Tiangen瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，回收片段克隆到pGEM-T Easy（Promega）載體，轉(zhuǎn)化 STBL3 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)綿羊不同組織中Trim28表達(dá)量

分別以中國(guó)美利奴細(xì)毛羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢組織cDNA為模板，以綿羊GAPDH為內(nèi)參，用Roche羅氏LightCycler 480II儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系25 μL，其中：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，ddH2O 9.5 μL，綿羊各組織cDNA 1 μL。每個(gè)組織樣本設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并同時(shí)設(shè)無模板對(duì)照組。RT-qPCR條件為：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s、60℃復(fù)性和延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，以 0.1℃/s的速度進(jìn)行溶解曲線分析。分別讀取目的基因和持家基因的 CT值，利用ΔCt法(Qr=2－ΔΔCt)計(jì)算 TRIM28基因在綿羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

TRIM28基因序列比對(duì)及同源性分析使用DNAMAN及 NCBI網(wǎng)站在線分析工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；蛋白質(zhì)親水性疏水性預(yù)測(cè)采用Epasy服務(wù)器上的 protscale程序（http://web.expasy.org/protscale/）；信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用 SignalP 4.0；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，并利用SWISS-MODLE軟件(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 PCR引物Tab.1 Primers of PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織RNA提取

各組織樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，均可清晰見到18S、28S、5S條帶，無蛋白和基因組污染。核酸蛋白分析儀檢測(cè)所有樣品A260/A280均介于1.9-2.0。說明RNA質(zhì)量達(dá)到反轉(zhuǎn)錄要求。

2.2 綿羊TRIM28基因CDS區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

以中國(guó)美利奴細(xì)毛羊卵巢組織cDNA為模板，克隆獲得2441 bp目的片段，克隆測(cè)序后比對(duì)，與UCSC綿羊基因組序列100%一致，與GeneBank公布的牛TRIM28序列同源性達(dá)到97.62%，因此，確定其為綿羊TRIM28基因。

2.2.1 綿羊TRIM28蛋白的理化性質(zhì)

運(yùn)用ExPASy軟件對(duì)綿羊TRIM28蛋白的氨基酸序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，其分析結(jié)果（圖1）表明：蛋白總共811個(gè)氨基酸，分子量為86503.4 u，理論等電點(diǎn)pI=5.47；含有20種氨基酸，其中含量最高的是 Ala（10.1%），含量最低的是 Trp（0.6%）；280 nm的摩爾吸光系數(shù)為44400 M-1·cm-1；蛋白平均親水系數(shù)為–0.387。

圖1 綿羊TRIM28基因CDS堿基和氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and amino acid sequence of sheep TRIM28 gene

2.2.2 蛋白親水/疏水性分析

運(yùn)用ProtScale程序?qū)d羊TRIM28親水性/疏水性進(jìn)行了分析，如圖2所示。第50位精氨酸（Arg）親水性最強(qiáng)（最低分值為-2.922）；第687位亮氨酸（Leu）疏水性最強(qiáng)(最高分值為1.778)。序列包含1個(gè)富含半胱氨酸的基序，可以與2個(gè)鋅離子以一種特異的交叉聯(lián)結(jié)體系結(jié)合。由于鋅離子的螯合作用，此區(qū)域形成了1個(gè)公共的疏水核心，而且在保守的連接區(qū)之間變化的序列則提供了蛋白相互識(shí)別、相互作用的特異性。

圖2 綿羊TRIM28蛋白疏水性分析Fig.2 Analysis of hydrophobicity of sheep TRIM28 protein

2.2.3 綿羊TRIM28蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

經(jīng)SOPMA服務(wù)器分析，綿羊的TRIM28蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸帶、β-折疊及無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，其中各種結(jié)構(gòu)所占比例分別為34.90%、14.67%、7.40%和43.03%。運(yùn)用SWISS-MO DEL進(jìn)行同源建模，結(jié)果（圖3）顯示：綿羊TRIM28蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也是由α-螺旋、延伸帶、β-折疊及無規(guī)則卷曲構(gòu)成。

圖3 綿羊TRIM28蛋白預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)及結(jié)構(gòu)域Fig.3 Putative Tertiary structure of sheep TRIM28 protein

2.2.4 綿羊TRIM28同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找另外10個(gè)物種的TRIM28基因編碼蛋白序列，采用MegAlign軟件進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示其與其他物種具有較高同源性。用NJ法構(gòu)建綿羊、人、狼、兔、牛、黑猩猩、鼠兔、馬、鼠、雞、駱駝、非洲爪蟾12個(gè)物種TRIM28基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果顯示，牛與綿羊在系統(tǒng)發(fā)育樹中關(guān)系最近。

圖4 不同物種TRIM28基因進(jìn)化樹Fig.4 The evolution of TRIM28 bases sequences among different species

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRIM28基因及相關(guān)互作基因在綿羊各個(gè)組織器官中的表達(dá)

以3只美利奴細(xì)毛羊不同組織的cDNA為模板，對(duì) TRIM28、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Zfp57、Setdb1和Gapdh基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，TRIM28 mRNA在綿羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢組織中均有表達(dá)，TRIM28基因在肺臟中表達(dá)量最高，在肝臟中最低（圖5）。

圖5 綿羊TRIM28基因mRNA表達(dá)譜Fig.5 The TRIM28 gene mRNA expression patterns in different tissues of sheep

另外，對(duì)與其互作參與甲基化調(diào)控的基因進(jìn)行了表達(dá)量的檢測(cè)，并用HemI 1.0：Heatmap Illustrator軟件繪制出各個(gè)基因在不同組織中表達(dá)量的熱點(diǎn)圖（圖6），熱點(diǎn)圖形象直觀描述出TRIM28基因和與其相互作用參與DNA甲基化調(diào)控的相關(guān)基因在綿羊不同組織中的差異表達(dá)情況。根據(jù)軟件的聚類分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TRIM28與Zfp57在不同組織中的表達(dá)情況基本一致。

圖6 TRIM28及互作甲基化調(diào)控相關(guān)基因在綿羊不同組織中表達(dá)的聚類分析Fig.6 Clustering of differentially expressed TRIM28 and methylation-related genes in tissues of sheep

3 討論

（1）本研究克隆得到了綿羊TRIM28基因完整CDS序列，長(zhǎng)度為2441 bp。 獲得的該基因核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列與人、牛、豬、小鼠等動(dòng)物核苷酸序列和氨基酸序列具有非常高的一致性，并且其蛋白結(jié)構(gòu)與TRIM家族蛋白的典型保守結(jié)構(gòu)域相符，說明其在不同物種間具有高度保守性，而這種高度保守結(jié)構(gòu)也證明了綿羊TRIM28基因具有特定或是廣泛的生物學(xué)功能作用。

（2）本研究表明TRIM28在美利奴細(xì)毛羊不同分化組織中均有表達(dá)。與TRIM28在小鼠卵巢和早期胚胎中高表達(dá)相比較，在正常分化細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到存在差異，這種現(xiàn)象可能是物種差異造成。TRIM28在癌癥研究中較為熱門的是與肺癌有關(guān)，TRIM28在綿羊肺部組織中的表達(dá)量最高，這可能與其在肺部具有某些特定功能有關(guān)聯(lián)。目前對(duì)TRIM28蛋白確切功能及其作用機(jī)制尚不清楚，尤其是其作為母源因子涉及卵母細(xì)胞發(fā)育成熟和附植前早期胚胎發(fā)育過程中廣泛的生理生化功能。小鼠早期胚胎發(fā)育的研究表明，TRIM28能通過與ZFP57結(jié)合，作為中央支持骨架與H3K9組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1，核小體重塑和組蛋白去乙酰化復(fù)合體NuRD，異染色質(zhì)蛋白 HP1，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1，DNMT3A，DNMT3B組成一個(gè)多重功能的阻遏復(fù)合結(jié)構(gòu)，在表觀重編程中起到印記基因甲基化維持作用。本研究通過檢測(cè)綿羊正常分化組織中上述基因的表達(dá)情況，聚類分析結(jié)果表明TRIM28與Zfp57表達(dá)情況最相似，這可能ZFP57/TRIM28復(fù)合結(jié)構(gòu)在正常分化細(xì)胞分裂增殖過程中DNA甲基化的維持也同樣起著重要作用。

TRIM28是具有多重結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與一系列基因的激活與抑制密切相關(guān)，涉及廣泛的生物學(xué)或生理學(xué)過程。TRIM28的表達(dá)異常直接導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化的紊亂[1，10-12]。腫瘤生物學(xué)上研究發(fā)現(xiàn)，TRIM28作為P53的輔阻遏物能夠結(jié)合到MDM2上，可抑制P53的表達(dá)和乙?；饔肹13]。TRIM28在癌細(xì)胞和腫瘤中表達(dá)量較正常組織升高，Lu Chen等發(fā)現(xiàn)TRIM28能通過HDAC1/E2F作用減緩早期肺癌細(xì)胞的增殖，揭示了其在抑制癌癥方面的重要作用[14]。近幾年，TRIM28在干細(xì)胞領(lǐng)域研究中成為熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn) TRIM28在精子生成，胚胎干細(xì)胞（ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）的維持中發(fā)揮重要作用[15-18]。此外，除了作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的廣泛重要作用，TRIM28對(duì)發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)域的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)也起著重要作用[19]。由于TRIM28在大動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程方面的研究處于起步階段，其功能尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

采用RT-PCR技術(shù)獲得TRIM28基因完整的編碼區(qū)序列，其序列全長(zhǎng)2441 bp，編碼811個(gè)氨基酸，與其他物種存在較高的相似性。TRIM28結(jié)構(gòu)和進(jìn)化的高度保守，可能與其在不同組織中行使轉(zhuǎn)錄中介因子這一特定的生物學(xué)功能相關(guān)。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，TRIM28 mRNA在中國(guó)美利奴細(xì)毛羊肺臟、脾臟和卵巢中高豐度表達(dá)，且與Zfp57 mRNA在所有檢測(cè)組織中表達(dá)情況一致。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的TRIM28基因?yàn)檫M(jìn)一步研究TRIM28作為母源因子在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中所起的作用奠定了必要的基礎(chǔ)。

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Cloning and bioinformatics analysis of the CDS of ovis aries TRIM28 gene

Luo Jian1,2,Wang Liming2,Zhang Yiyuan2,Guo Yanhua2,Tang Hong2,Zhou Pin2*,Liu Shouren2*
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Key Laboratory for Sheep Improvement and Healthy Production,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

In order to study the mechanisms of TRIM28 in the establishment of methylation and demethylation during somatic cell nuclear transfer (SCNT)early embryonic development，which could help to explain the role of key maternal factor for reprograming of somatic cell.The RNA was extracted from ovary,and cDNA was obtained by reverse transcription.Specific primers were designed to amplify the coding sequence of TRIM28 gene.The sequence of coding region and amino acid of TRIM28 were analyzed and predicted by bioinformatics methods.The expression patterns in different tissues were detected by real-time RT-PCR.The results showed that we obtained the sheep TRIM28 gene 2441 bp cDNA coding sequence,coding 811 amino acids.TRIM28 mRNA expression level showed that the levels were the highest in lung and the lowest in liver，which was in according with the level of Zfp57.The TRIM28 is highly conserved with other species and may act as an essential transcriptional regulator and a multifunctional adaptor protein with the same to model animals.Moreover,the Zfp57/Kap1 complex can play important role in epigenetic regulation system controlling of DNA methylation in the differentiated tissues.

TRIM28； Zfp57； maternal gene； DNA methylation； bioinformatics

S826.2

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.002

1007-7383(2017)02-0139-07

2016-03-24

國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)（2014ZX08008001），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160227、3166090049），新疆兵團(tuán)種質(zhì)資源創(chuàng)新專項(xiàng)（2012BB042）

羅健(1989-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，e-mail:luojian_bio@126.com。

*通信作者：劉守仁（1934-），男，中國(guó)工程院院士，博士生導(dǎo)師，從事綿羊遺傳育種與繁殖研究，e-mail:nkyysb@163.com。