B16細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型的建立

朱禎慧， 朱麗清， 陳金妹， 林嬌芬， 潘裕添

(閩南師范大學(xué) 菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心, 福建 漳州 363000)

?

B16細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型的建立

朱禎慧， 朱麗清， 陳金妹， 林嬌芬， 潘裕添*

(閩南師范大學(xué) 菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心, 福建 漳州 363000)

初步建立小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)的共培養(yǎng)模型，利用熊果苷和8-甲氧補(bǔ)骨脂素(8-MOP)對(duì)此模型進(jìn)行作用驗(yàn)證.使用10%DMEM完全培養(yǎng)基對(duì)B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，嘗試不同的細(xì)胞接種順序和細(xì)胞接種濃度構(gòu)建共培養(yǎng)模型；將不同濃度的熊果苷和8-MOP作用到共培養(yǎng)模型中，通過(guò)測(cè)細(xì)胞毒性、黑色素含量和酪氨酸酶含量來(lái)驗(yàn)證模型的可靠性.結(jié)果表明，細(xì)胞接種順序?qū)才囵B(yǎng)模型沒有影響，采用B16細(xì)胞數(shù)量：HaCaT細(xì)胞數(shù)量為1∶4為最終細(xì)胞接種濃度比例；當(dāng)熊果苷為100μg/mL時(shí)對(duì)黑色素含量和酪氨酸酶含量達(dá)到最高抑制效果；當(dāng)8-MOP為20μg/mL時(shí)對(duì)黑色素含量和酪氨酸酶含量達(dá)到最高促進(jìn)效果，均與單獨(dú)B16細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致.有效構(gòu)建了B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)模型，并且可以將該模型運(yùn)用于篩選抑制/促進(jìn)黑色素藥物中.

B16細(xì)胞； HaCaT細(xì)胞； 共培養(yǎng)模型； 熊果苷； 8-MOP

0 引言

人類的表皮黑素單元由黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共同作用組成，在人類的日常生活中起著重要的作用，正常情況下，一個(gè)表皮黑素單位由一個(gè)黑素細(xì)胞和周圍約36個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞相接觸組成[1,2].B16細(xì)胞是美白劑篩選重要細(xì)胞模型，但由于體外單種細(xì)胞培養(yǎng)仍舊不可避免的與人體細(xì)胞的生理環(huán)境有所差異[3,4]，因此，為了彌補(bǔ)現(xiàn)代單種細(xì)胞培養(yǎng)的局限性，B16細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)成為研究熱點(diǎn).自Halaban首次成功建立黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型[5]，眾多建立在此模型基礎(chǔ)上的共培養(yǎng)模型也相繼涌現(xiàn)，考慮到人黑素細(xì)胞較難培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)成本較大[6]，因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)和人永生化角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)的共培養(yǎng)模型，并且使用熊果苷和8-甲氧補(bǔ)骨脂素(8-MOP)兩種完全不同作用效果的藥物，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞毒性[7,8]，黑色素含量和酪氨酸酶活性等指標(biāo)驗(yàn)證其對(duì)所建模型的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)肌膚美白作用物質(zhì)的篩選具有重要的科學(xué)參考和應(yīng)用價(jià)值.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16 細(xì)胞)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞( HaCaT 細(xì)胞)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).

1.1.2 主要試劑

DMEM (12800) ，0.25% Trypsin-EDTA(1X)，購(gòu)自上海魯汶生物科技有限公司； CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay ，購(gòu)自普洛麥格(北京)生物科技有限公司；熊果苷，分析純，購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；8-甲氧補(bǔ)骨脂，分析純，購(gòu)自西格瑪奧德里奇中國(guó)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.1.3 主要儀器

HF safe生物安全柜,購(gòu)自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Celculture CO2INCUBATOR,購(gòu)自新加坡藝思高科技(上海)有限公司；Centrifuge 5810 R,購(gòu)自艾本德中國(guó)有限公司；Infinite M 200 PRO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,購(gòu)自上海迪奧生物科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用10% DMEM完全培養(yǎng)基對(duì)B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別消化，離心，重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋至5×104個(gè)/mL[9]，按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行接種.

1.2.2 共培養(yǎng)模型建立[6]

(1)細(xì)胞接種順序?qū)才囵B(yǎng)模型的影響：將相同細(xì)胞濃度的B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞懸液備好，分為A組：先接種5 mL B16細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后接種5 mL HaCaT細(xì)胞；B組：先接種 5 mL HaCaT細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后接種5 mL B16細(xì)胞；C組：先接種2.5 mL B16細(xì)胞和2.5 mL HaCaT細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后依舊接種2.5 mL B16細(xì)胞和2.5 mL HaCaT細(xì)胞.繼續(xù)培養(yǎng)24 h后拍照觀察是否有影響.

(2)細(xì)胞接種濃度對(duì)共培養(yǎng)模型的影響：將相同細(xì)胞濃度的B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞懸液備好，分別按B16細(xì)胞數(shù)量：HaCaT細(xì)胞數(shù)量為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10接種培養(yǎng).拍照觀察.

1.2.3 熊果苷和8-MOP對(duì)共培養(yǎng)模型的影響

(1)MTS法檢測(cè)細(xì)胞毒性[10]：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的B16細(xì)胞消化，離心，重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，按照每孔100μL接種于96孔板中，24 h后每孔加藥100μL，熊果苷濃度分別為10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL，以不加藥組作為空白對(duì)照.分別加藥培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔加入20μL MTS，37 ℃孵育2 h后進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測(cè)，酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)定為：中速振蕩30 s，靜置10 s，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm.

分別對(duì)HaCaT細(xì)胞和共培養(yǎng)細(xì)胞測(cè)細(xì)胞毒性，方法同上.

細(xì)胞相對(duì)增殖率(%)=[(細(xì)胞加藥組Abs值-加藥培養(yǎng)基Abs值)/(空白對(duì)照組Abs值-培養(yǎng)基Abs值)]*100%

(2)熊果苷和8-MOP對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量影響[11]：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的共培養(yǎng)細(xì)胞消化，離心，重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為30×104個(gè)/mL，按照每孔0.5 mL接種于24孔板，重復(fù)接種兩塊板，24 h后每孔加藥1 mL，熊果苷濃度分別為10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，以不加藥組作為空白對(duì)照.加藥培養(yǎng)24 h，將一塊24孔板的培養(yǎng)基吸棄，冰PBS洗三遍，按照每孔加入1 mL 1mol/L NAOH含10% DMSO的溶液，80 ℃加熱1 h，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)試得到B1值；同時(shí)對(duì)另一塊24孔板吸棄培養(yǎng)基后，按照每孔0.5 mL培養(yǎng)基， 再加入50μL MTS，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)試得到B2值以作校正.對(duì)單獨(dú)B16細(xì)胞進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)操作用作對(duì)照組.

黑色素含量=吸光度值B1/吸光度值B2

操作方法同上.8-MOP濃度分別為5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，以不加藥組作為空白對(duì)照.對(duì)單獨(dú)B16細(xì)胞進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)操作用作對(duì)照組.

(3)熊果苷和8-MOP對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性影響[12]：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的共培養(yǎng)細(xì)胞消化，離心，重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為30×104個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h后加藥，熊果苷濃度分別為10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，以不加藥組作為空白對(duì)照.加藥培養(yǎng)24 h，舊液去除，冰PBS洗三遍，向細(xì)胞沉淀中加入5倍細(xì)胞沉淀體積的0.05 mol/L PBS，重懸細(xì)胞，-20 ℃放置30 min.回溫，速凍速溶5次，4 ℃條件下高速離心9 000 rpm，15 min兩次得上清液即為所需酶液.測(cè)量時(shí)向780μL 100 mmol/L PBS中加入200μL 5mmol/L L-DOPA，37 ℃水浴加熱10 min，然后加入20μL酶液，37 ℃水浴加熱5 min，酶標(biāo)儀475 nm處測(cè)試得到T1值.用考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白法對(duì)酶液進(jìn)行測(cè)量得到T2值以作校正.OD值與酪氨酸酶活性呈正相關(guān).對(duì)單獨(dú)B16細(xì)胞進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)操作用作對(duì)照組.

酪氨酸酶活性=吸光度值T1/吸光度值T2

操作方法同上.8-MOP濃度分別為5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，以不加藥組作為空白對(duì)照.對(duì)單獨(dú)B16細(xì)胞進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)操作用作對(duì)照組.

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞接種順序?qū)才囵B(yǎng)模型的影響結(jié)果

不同細(xì)胞接種順序?qū)才囵B(yǎng)模型影響的結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，細(xì)胞接種順序不同培養(yǎng)相同時(shí)間后，各組細(xì)胞均正常生長(zhǎng)且細(xì)胞形態(tài)沒有明顯區(qū)別.培養(yǎng)48 h后，三組均可見到兩種細(xì)胞接觸共存貼壁生長(zhǎng).因此，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的便捷，采用直接兩種細(xì)胞同時(shí)混合接種的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還可明顯觀察到，B16細(xì)胞具有明顯的突觸，其突觸伸長(zhǎng)觸及HaCat細(xì)胞上，B16細(xì)胞突觸是成熟黑色素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)的一條高速通路，可見共培養(yǎng)模型對(duì)于研究B16和HaCat細(xì)胞間的黑色素的轉(zhuǎn)運(yùn)具備可行性.

a：B16細(xì)胞，體積較小，形狀不規(guī)則；b：HaCaT細(xì)胞，體積較大，偏圓形；箭頭：B16細(xì)胞突觸連接到HaCaT細(xì)胞，共同生長(zhǎng)圖1 不同接種順序?qū)?xì)胞共培養(yǎng)模型影響結(jié)果(100×)

2.2 細(xì)胞接種濃度對(duì)共培養(yǎng)模型的影響結(jié)果

不同細(xì)胞接種濃度對(duì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型影響的結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，在相同的細(xì)胞濃度條件下，當(dāng)B16細(xì)胞數(shù)量∶HaCaT細(xì)胞數(shù)量分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時(shí)，共培養(yǎng)細(xì)胞相互接觸生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)正常，基本沒有死細(xì)胞；而當(dāng)B16細(xì)胞數(shù)量∶HaCaT細(xì)胞數(shù)量分別為1∶5、1∶10時(shí)，可以看到，96 h時(shí)共培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，有部分細(xì)胞已經(jīng)死亡，漂浮在培養(yǎng)基上層.隨著HaCaT細(xì)胞接種數(shù)量的增加，96 h時(shí)共培養(yǎng)模型中的HaCaT細(xì)胞數(shù)量則越多，由于人類表皮黑色單元中角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多于黑色細(xì)胞數(shù)量，因此，HaCaT細(xì)胞數(shù)量越多則越接近人類的正常比例，符合實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo).因此，選擇B16細(xì)胞數(shù)量∶HaCaT細(xì)胞數(shù)量為1∶4作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)濃度比例.

2.3 熊果苷和8-MOP對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞模型影響結(jié)果

2.3.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，隨著熊果苷作用濃度和作用時(shí)間的增加，其對(duì)B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞的抑制作用明顯；尤其在作用時(shí)間為72 h時(shí)，不同濃度的熊果苷對(duì)B16細(xì)胞均有極顯著抑制(P<0.001)，其中當(dāng)熊果苷作用濃度為500μg/mL時(shí)細(xì)胞毒性達(dá)到2級(jí)[13]；隨著熊果苷作用濃度和作用時(shí)間的增加，其對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的抑制作用與單獨(dú)培養(yǎng)的B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞毒性趨勢(shì)一致，因此可以確定共培養(yǎng)不改變兩種細(xì)胞對(duì)熊果苷的作用效應(yīng)趨勢(shì).

a：B16細(xì)胞，體積較小，形狀不規(guī)則；b：HaCaT細(xì)胞，體積較大，偏圓形；c：死亡細(xì)胞，呈懸浮狀態(tài)；箭頭：B16細(xì)胞突觸連接到HaCaT細(xì)胞，共同生長(zhǎng)

(a)兩種細(xì)胞接種24 h，B16未生長(zhǎng)出觸角，HaCaT細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，均處于生長(zhǎng)階段，還未接觸生長(zhǎng) (b)兩種細(xì)胞接種48 h，B16細(xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)出觸角且向HaCaT細(xì)胞連接生長(zhǎng)

(c)兩種細(xì)胞接種72 h,B16細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均已成熟且接觸生長(zhǎng)，B16細(xì)胞的觸角融合于HaCaT細(xì)胞內(nèi) (d)兩種細(xì)胞接種96 h，B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞連接生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量很多且聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞之間分界不明圖2 不同接種濃度對(duì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型影響結(jié)果(100×)

細(xì)胞模型熊果苷濃度/(μg/mL)細(xì)胞相對(duì)增殖率/%24h48h72hB16細(xì)胞1099.2187±2.882890.6890±2.4861 79.0542±1.5666***5097.2115±1.508688.7868±2.541377.9094±2.1035***10095.6813±1.170588.6129±3.492572.2601±1.8774***20095.6628±1.468287.2123±2.757471.1007±2.1001***50089.0364±1.1866*67.0537±0.8912***66.7830±1.6798***HaCaT細(xì)胞1099.2668±2.203298.1524±2.3431 98.1289±1.2007 5099.2942±3.823897.7528±2.147987.8746±1.4388**10092.7019±3.011396.1350±2.040386.3302±2.1419**20088.6573±3.397689.4089±1.994278.3121±1.4999***50087.2105±2.087181.7585±2.224074.8310±1.6469***共培養(yǎng)細(xì)胞1099.6932±2.169792.2838±3.1074 89.1651±0.9807***5093.9872±2.303986.3991±3.616786.0897±1.3613***10093.9379±3.147286.1874±2.646385.7270±1.7506***20091.4788±2.558485.7116±4.0892*84.5416±1.2222***50081.8800±3.2283*75.3033±1.6258**72.0431±1.1281***

*表示不同濃度加藥組與空白對(duì)照組之間的顯著性：P*<0.05，P**<0.01，P***<0.001.

由表2可知，隨著8-MOP作用濃度的增加，在不同的時(shí)間點(diǎn)，8-MOP對(duì)三種細(xì)胞模型均有抑制增殖，因此可以確定共培養(yǎng)不改變兩種細(xì)胞對(duì)8-MOP的作用效應(yīng).當(dāng)作用時(shí)間為72 h時(shí)，8-MOP均對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞有抑制效果比B16細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞單獨(dú)作用明顯顯著，且除當(dāng)8-MOP作用濃度為30μg/mL外均具有濃度依賴性.

表2 不同濃度和作用時(shí)間的8-MOP對(duì)細(xì)胞模型增殖率影響結(jié)果

2.3.2 熊果苷和8-MOP對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量影響結(jié)果

不同濃度的熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量影響結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，隨著熊果苷作用濃度的增加，共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量逐漸減少，當(dāng)加藥組與空白組對(duì)比時(shí)，在熊果苷作用濃度為50μg/mL時(shí)，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞已經(jīng)有了顯著的抑制黑色素生成效果(P<0.01).與相同濃度的熊果苷對(duì)單獨(dú)B16細(xì)胞作用趨勢(shì)一致，說(shuō)明共培養(yǎng)細(xì)胞模型適合對(duì)熊果苷之類的美白劑進(jìn)行篩選.

圖3 不同濃度的熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量影響結(jié)果

不同濃度的8-MOP對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量影響結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，隨著8-MOP作用濃度的增加，共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量逐漸增加，當(dāng)加藥組與空白組對(duì)比時(shí)，加藥組的共培養(yǎng)細(xì)胞均有顯著的促黑效果(P<0.001).說(shuō)明共培養(yǎng)細(xì)胞模型可以對(duì)8-MOP之類的促黑藥進(jìn)行篩選.

2.3.3 熊果苷和8-MOP對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性影響結(jié)果

不同濃度的熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性影響結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，隨著熊果苷濃度的增加，其對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性抑制作用越明顯，并具有濃度依賴性.在熊果苷作用濃度為100μg/mL時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶活性抑制的作用最為顯著(P<0.001).與相同濃度的熊果苷對(duì)單獨(dú)B16細(xì)胞作用趨勢(shì)一致且變化更明顯，說(shuō)明共培養(yǎng)細(xì)胞模型可以對(duì)熊果苷之類的陽(yáng)性藥進(jìn)行篩選.

圖4 不同濃度的8-MOP對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素含量影響結(jié)果

圖5 不同濃度的熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性影響結(jié)果

不同濃度的8-MOP對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性影響結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，隨著8-MOP濃度的增加，其對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性促進(jìn)作用越明顯，尤其在8-MOP作用濃度為20μg/mL時(shí)，其對(duì)酶活性促進(jìn)的作用最為顯著(P<0.001).說(shuō)明共培養(yǎng)細(xì)胞模型可以對(duì)8-MOP之類的促黑藥進(jìn)行篩選.

圖6 不同濃度的8-MOP對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的酪氨酸酶活性影響結(jié)果

3 結(jié)論

細(xì)胞共培養(yǎng)模型是科學(xué)研究的需要，通過(guò)建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型，不僅可以直接觀察細(xì)胞之間的相互作用，而且從最大程度上模擬人體正常的生理狀態(tài)，從而彌補(bǔ)了單種細(xì)胞培養(yǎng)不相似人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的遺憾[14].本實(shí)驗(yàn)采用兩種細(xì)胞直接接觸培養(yǎng)的方法[15]，考慮到人體黑色素細(xì)胞較難培養(yǎng)，為節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，因此選擇了鼠源黑色素瘤細(xì)胞與人源角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)兩種細(xì)胞接種順序和細(xì)胞接種濃度的不同，首先構(gòu)建最符合人體要求的共培養(yǎng)模型，實(shí)驗(yàn)得到兩種細(xì)胞的接種順序?qū)才囵B(yǎng)模型的構(gòu)建并沒有影響，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)均良好；在細(xì)胞接種濃度探索實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)B16細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞數(shù)目比為1∶4時(shí)，共培養(yǎng)模型可以在維持正常生長(zhǎng)的狀態(tài)下盡量達(dá)到研究的合理要求.然后運(yùn)用熊果苷和8-MOP對(duì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型與單種細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行作用效果比較，驗(yàn)證共培養(yǎng)模型篩選藥物的結(jié)果與單種細(xì)胞篩選藥物的結(jié)果是否一致[16，17]，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與單獨(dú)B16細(xì)胞作用趨勢(shì)一致.因此，本實(shí)驗(yàn)建立的共培養(yǎng)模型可以作為更有效的仿真方法來(lái)對(duì)肌膚美白或者促黑素藥物進(jìn)行篩選.

[1] 馬慧軍,趙 廣.皮膚色素沉著發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)雜志,2006,15(9):1 090-1 092.

[2] Yoon T J,Hearing V J.Co-culture of mouse epidermal cells for studies of pigmentation[J].Pigment Cell Research,2003,16(2):159-163.

[3] 王天曄,王興焱,陳巧云,等.細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)在美白藥物研究中的應(yīng)用及前景[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)雜志,2010,19(9):1 401-1 403.

[4] 吳新星,姜興濤,余漢謀,等.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在美白功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].日用化學(xué)品科學(xué),2015,38(11):39-41.

[5] Halaban R,Langdon R,Birchall N,et al.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes[J].Journal of Cell Biology,1988,107(4):1 611-1 619.

[6] 解士海.人表皮黑素細(xì)胞—角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)及11種化合物對(duì)黑素沉著的影響研究[D].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2006.

[7] Arung E T,Yoshikawa K,Shimizu K,et al.The effect of chlorophorin and its derivative on melanin biosynthesis[J].Holzforschung,2005,59(5):514-518.

[8] Costantino V V,Lobosgonzalez L,Ibaez J,et al.Dehydroleucodine inhibits tumor growth in a preclinical melanoma model by inducing cell cycle arrest,senescence and apoptosis[J].Cancer Letters,2016,372(1):10-23.

[9] 陳易彬,徐 錦,王 敏,等.黑木耳甲醇提取物抑制黑色素的研究[J].食品工業(yè)科技,2015(21):111-114.

[10] Cory A H,Owen T C,Barltrop J A,et al.Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture[J].Cancer Communications,1991,3(7):207-210.

[11] 郭殷銳,李沁瑩,張廣唱,等.馬鞭草經(jīng)皮透過(guò)液對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的作用[J].中藥新藥與臨床藥理,2016,27(1):19-22.

[12] 黃海潮,鄭公銘,王如意,等.柯里拉京對(duì)B16細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性的抑制作用[J].日用化學(xué)工業(yè),2016,46(1):44-47.

[13] 王 昕,施嬿平,朱雪濤,等.醫(yī)用聚酯類材料的細(xì)胞毒性試驗(yàn)[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,2003,22(2):39-40.

[14] 羅 云,孫桂波,秦 蒙,等.細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(22):3 345-3 349.

[15] 李 拉,陳文慶,朱敬先,等.直接接觸共培養(yǎng)技術(shù)在體外探索細(xì)胞間相互作用的應(yīng)用研究[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2013,32(4):337-342.

[16] 劉邦民,張 涓,陶春蓉,等.驗(yàn)方祛斑湯對(duì)A375人黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(1):209-210.

[17] 雷鐵池,朱文元,夏明玉,等.8-甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成的調(diào)節(jié)及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究[J].中華皮膚科雜志,1999,32(2):115-118.

【責(zé)任編輯：陳 佳】

Construction of the co-culture model of B16 cells and HaCaT cells in vitro

ZHU Zhen-hui, ZHU Li-qing, CHEN Jin-mei, LIN Jiao-fen, PAN Yu-tian*

(The Engineering Technological Center of Mushroom Industry, Minnan Normal University, Zhangzhou 363000, China)

The co-culture model of Murine Melanoma cells (B16 cells) and human keratinocytes (HaCaT cells) was established,and the effect of the model by arbutin and 8-MOP.B16 cells and HaCaT cells were cultured in 10% DMEM medium.Different inoculation sequences of cell and inoculation concentrations of cell were used to construct co-culture model.After arbutin and 8-MOP were added to the model,the cytotoxicity,melanin content and tyrosinase activity were measured to verify the reliability of the model.The results showed that the sequences of cell inoculation had no effect on the co-culture model;B16 cells was co-culture with HaCaT cells as 1∶4 ratio;the highest inhibitory effect of arbutin on the melanin content and tyrosinase activity at the concentration of 100μg / ml;the 8-MOP had the lowest inhibitory effect on melanin content and tyrosinase activity at the concentration of 20μg / ml,all of these like as the previous study of only B16 cells.The co-culture model of B16 cells and HaCaT cells was established effectively in this study and it can be used to screen the drugs of promoting or inhibiting melanin.

B16 cells; HaCaT cells; co-culture; arbutin; 8-MOP

2017-03-12

福建省科技廳青年科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2015J05071)

朱禎慧(1992-)，女，山西臨汾人，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物通訊作者:潘裕添(1969-)，男，福建漳州人，教授，研究方向：天然產(chǎn)物，xmpyt@sina.com

2096-398X(2017)04-0132-06

Q2-3

A