干酪乳桿菌抗熱保護(hù)劑的Plackett-Burman試驗(yàn)研究

陳 合， 寇建波， 楊 妍， 張 萍， 舒國偉

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

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干酪乳桿菌抗熱保護(hù)劑的Plackett-Burman試驗(yàn)研究

陳 合， 寇建波， 楊 妍， 張 萍， 舒國偉

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

益生菌是功能性食品的主要功能因子，干酪乳桿菌L61具有較強(qiáng)的產(chǎn)抗氧化肽的能力.選取6種抗熱保護(hù)劑，采用Plackett-Burman試驗(yàn)研究其干酪乳桿菌L61的抗熱性能，以提高噴霧干燥制備干酪乳桿菌奶粉中的活菌數(shù)及抗氧化性.結(jié)果表明：甘油、脫脂乳和葡萄糖對干酪乳桿菌L61存活率影響最為顯著，優(yōu)化確定了 3種物質(zhì)作為干酪乳桿菌抗熱保護(hù)劑的最適添加量，即脫脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L，為噴霧干燥制備高活性干酪乳桿菌奶粉提供了技術(shù)依據(jù).

抗熱保護(hù)劑； 干酪乳桿菌L61； 羊奶粉； 抗氧化

0 引言

益生菌是維護(hù)人體健康的重要功能因子[1].干酪乳桿菌作為益生菌的一種，進(jìn)入人體后可在腸道內(nèi)存活，調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)腸道消化吸收[2]、具有降膽固醇、增強(qiáng)免疫及預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長等保健作用[3,4].已廣泛應(yīng)用于功能性食品中，特別是乳制品的開發(fā).

自20世紀(jì)50年代Harman提出了自由基學(xué)說(free radical theory)以來，人們逐漸認(rèn)識到人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與其衰老及許多疾病有關(guān).因此，具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化功能的抗氧化劑成為研究的熱點(diǎn)，乳源抗氧化肽等天然抗氧化肽更是引起人們的關(guān)注[5-7].

目前乳源抗氧化肽主要采用酶解蛋白制備，發(fā)酵乳蛋白制備抗氧化肽的文獻(xiàn)不多，而關(guān)于抗氧化的益生菌產(chǎn)品、特別是含有產(chǎn)抗氧化肽的益生菌奶粉少有報(bào)道.課題組在前期從25株益生菌中篩選出四株發(fā)酵羊乳產(chǎn)抗氧化肽能力較強(qiáng)的乳桿菌[8]，并對干酪乳桿菌L61發(fā)酵羊乳產(chǎn)抗氧化肽的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化.本研究在此基礎(chǔ)上，以含抗氧化肽的益生菌發(fā)酵羊乳為原料，采用噴霧干燥制備干酪乳桿菌L61抗氧化益生菌羊奶粉，研究篩選抗熱保護(hù)劑，以改變在噴霧干燥過程中的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕高溫對細(xì)胞損害，提高干酪乳桿菌的存活率[9,10]，為后續(xù)抗氧化益生菌羊奶粉的中試及產(chǎn)業(yè)化提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料：干酪乳桿菌L61，陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；脫脂羊乳粉，富平縣秦源乳業(yè)有限公司； DPPH，Sigma公司；甘油、脫脂乳粉、葡萄糖等，均為食品級；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基，均為北京陸橋技術(shù)股份有限公司；復(fù)原乳培養(yǎng)基，蒸餾水將脫脂羊乳粉配制為11%(w/v)的復(fù)原羊乳，105 ℃滅菌15 min.

(2)主要儀器：YX.280D手提式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療器械廠；FA2004B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；LG10-2.4型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)，上海索映儀器設(shè)備有限公司；DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；DK.98.1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；pHs-3C型pH計(jì)，上海精科儀器公司；SW-CJ-IF無菌操作臺，蘇州江東精密儀器有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將冷凍保存的干酪乳桿菌L61菌粉接種于已滅菌冷卻的MRS肉湯培養(yǎng)基中，充分混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h得到一代活化液，再取上述活化液按5%(v/v)接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h得到二代活化液，如此重復(fù)活化三代，第三代培養(yǎng)時(shí)間為18 h.

將上述獲得的第三代活化液按5%接入11%(w/v)復(fù)原脫脂羊乳培養(yǎng)基中，混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至凝乳后置于4 ℃冰箱備用.

1.2.2 發(fā)酵乳制備

將11%復(fù)原脫脂羊乳于105 ℃滅菌15 min，待其冷卻后按5%接種量接入已活化菌種，置于41 ℃恒溫水浴發(fā)酵16 h后取出，得到含抗氧化肽的干酪乳桿菌發(fā)酵乳.

1.2.3 抗熱保護(hù)劑篩選

在干酪乳桿菌發(fā)酵乳中加入不同保護(hù)劑并于75 ℃恒溫水浴中保溫10 min.測定保溫前后活菌數(shù)并計(jì)算存活率.

1.2.4 檢測方法

(1)活菌數(shù)測定

按照GB 4789.35-2010，采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法，每一樣品選取三個稀釋梯度，每一梯度做三個平行實(shí)驗(yàn)以求得平均值.

(2)酸度測定

采用氫氧化鈉滴定法[11].取5 mL發(fā)酵液注入容量為150 mL的三角瓶中，加入45 mL蒸餾水稀釋，加入2～3滴1%酚酞指示劑，用0.l mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，不斷輕微搖動三角瓶，直至微紅色在30秒內(nèi)不消失為止，即為滴定終點(diǎn).將滴定時(shí)消耗的0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)乘以20，即為100 mL發(fā)酵液的滴定酸度(°T).

(3)pH測定

室溫下用pHs-3c測定.

(4)抗氧化性測定

發(fā)酵羊乳乳清樣品制備：將發(fā)酵乳充分震蕩搖勻并倒入燒杯中，測定pH.先用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵乳pH至3.4～3.6，5 000 r/min離心15 min，取上清液；將上清液再用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.3后，5 000 r/min離心15 min，取上清液，此上清液即為用于測定抗氧化性的待測樣品溶液[12].

羥自由基清除率表示抗氧化性大小.采用紫外分光光度計(jì)，分別移取2 mL待測樣品溶液、2 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)和2 mL過氧化氫溶液(10 mmol/L)注入到10 mL的試管中充分震蕩混合，37 ℃ 孵育10 min，加入2 mL水楊酸溶液(9 mmol/L)，混勻后37 ℃孵育30 min，于510 nm 處測定混合溶液的吸光度，每組三個平行，求平均值.純水做空白對照組[13].

清除率=(1-對照組/試驗(yàn)組) ×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett- Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

選取蔗糖(X2)、脫脂乳粉(X3)、葡萄糖(X4)、海藻糖(X6)、明膠(X8)、甘油(X9)等六種常見保護(hù)劑，設(shè)計(jì)高低水平(1和-1)P-B試驗(yàn).各個因素水平編碼如表1所示，P-B試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.其中X2、X4、X6 及X8為質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)，X3為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(g/L)，X9為體積分?jǐn)?shù)(mL/L)；響應(yīng)值Y1為菌體存活率(%)，Y2為羥基自由基清除率(%)，Y3為酸度(°T)，Y4為 pH值.不加保護(hù)劑作為對照組，存活率為0.68%.

表1 抗熱保護(hù)劑P-B篩選編碼表

表2 抗熱保護(hù)劑P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

隨著羊乳發(fā)酵的進(jìn)行，產(chǎn)酸增多，其pH值和酸度有所變化，但均在正常范圍內(nèi)，表明發(fā)酵性能良好.其各因子對響應(yīng)值Y1的置信區(qū)間如圖1所示，顯著效應(yīng)如圖2所示.對響應(yīng)值Y2的置信區(qū)間如圖3所示，顯著效應(yīng)如圖4所示.

圖1 各因子對于菌體存活率的置信區(qū)間

由圖1可知， X9對于響應(yīng)值Y1的影響呈正效應(yīng)，即菌體存活率隨著因子添加量的增加而增大；因子X2、X3、X4對于響應(yīng)值Y1的影響呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，即菌體存活率隨著因子添加量的增加而減?。灰蜃覺8、 X6對響應(yīng)值Y1幾乎無影響.其中X1、X5、X7為虛擬項(xiàng)，用于消除試驗(yàn)中誤差.

由圖2可以看出，因子X3對響應(yīng)值Y1的影響效果最明顯，并且各個因子對于菌體存活率的影響顯著性效果先后順序?yàn)椋篨4(葡萄糖)>X3(脫脂乳)>X9(甘油)>X2(蔗糖)>X6(海藻糖)>X8(明膠).P-B試驗(yàn)結(jié)果表明，影響菌體存活率較為突出的三個因子分別為脫脂乳、葡萄糖、甘油.

圖2 各因子對于菌體存活率的顯著性效應(yīng)圖

由圖3可知，因子X2、X3、X9對發(fā)酵羊乳抗氧化性的影響呈現(xiàn)正效應(yīng)，即響應(yīng)值Y2隨各因子添加量的增加而增大；而其余因子X4、X6、X8對于抗氧化性呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)關(guān)系，即抗氧化性隨著因子添加量的增加而減小.其中X1、X5、X7為虛擬項(xiàng).

圖3 各因子對抗氧化性的置信區(qū)間

從圖4可以看出，X6對響應(yīng)值Y2的影響最為顯著，各因子對發(fā)酵羊乳抗氧化性的顯著性依次為：X6(海藻糖)>X3(脫脂乳)>X4(葡萄糖)>X9(甘油)>X8(明膠)>X2(蔗糖).

圖4 各因子對抗氧化性的顯著性效應(yīng)圖

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果分析

各因子對發(fā)酵羊乳抗氧化性和菌體存活率結(jié)果不完全一致，因此進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).其中，a表示在發(fā)酵乳中添加脫脂乳、葡萄糖和海藻糖；b表示在發(fā)酵乳中添加脫脂乳、葡萄糖和甘油.其結(jié)果如表3所示.

表3 對比試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

本研究目的主要在于研究菌體保護(hù)劑，最大可能的提高菌體存活率，為后續(xù)工廠化采用噴霧干燥法制備益生菌羊奶粉篩選抗熱保護(hù)劑.同時(shí)，由表3可知，海藻糖與甘油對于發(fā)酵羊乳抗氧化性結(jié)果差異不是很大.因此，綜合分析考慮最終選取葡萄糖、脫脂乳、甘油三個因子的爬坡試驗(yàn).

2.3 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

基于上述結(jié)果確定葡萄糖、脫脂乳及甘油爬坡試驗(yàn)起點(diǎn)，選取合適的步長進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，確定后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn).爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表4所示.

由表4可知，爬坡實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵羊乳pH值隨著登高步數(shù)的增加先增后減；活菌數(shù)、存活率和抗氧化性隨著登高步數(shù)的增加均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)各因子添加量的取值在第二步時(shí)，菌體存活率及抗氧化性均達(dá)到最大值，即脫脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L

表4 抗熱保護(hù)劑爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 糖、乳及甘油抗熱保護(hù)劑分析

糖類保護(hù)劑生物作用目前有“水代替假說”和“玻璃態(tài)假說”兩種學(xué)說[14,15].其中“水代替假說”認(rèn)為糖的羥基可以代替蛋白質(zhì)極性基團(tuán)的周圍水分子形成氫鍵，達(dá)到保護(hù)菌體的作用；而“玻璃態(tài)假說”認(rèn)為糖-水混合物會發(fā)生玻璃化，保護(hù)劑包圍在蛋白質(zhì)周圍，防止蛋白質(zhì)變性.脫脂乳粉之所以可以起到良好的保護(hù)效果，是因?yàn)槿榍宓鞍自诰w細(xì)胞外可以形成一層蛋白膜，減少菌體胞壁破損引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外露[16].甘油進(jìn)入菌體細(xì)胞以后，使得胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增大，內(nèi)外壓力基本相等，從而有效的減緩了菌體因受熱時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)脫水的現(xiàn)象[17].

范娜等[18]研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體的抗熱保護(hù)劑，結(jié)果表明，海藻糖、明膠和甘油均能夠提高菌體的抗熱存活率，并且三者之間存在交互作用.

3 結(jié)論

葡萄糖、脫脂乳和甘油均對干酪乳桿菌L61有較好的抗熱保護(hù)作用，優(yōu)化確定的抗熱保護(hù)劑的最適添加量為脫脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L時(shí)，抗熱保護(hù)效果最佳，活菌數(shù)最高，為噴霧干燥制備高活性干酪乳桿菌奶粉提供了技術(shù)依據(jù).

[1] Thomas Heidebach,Petra Forst,Ulrich Kulozik.Microencapsulation of probiotic cells by means of rennet-gelation of milk proteins[J].Food Hydrocolloids，2009(23):1 670-1 677.

[2] 潘亞芬,向殿軍.酸乳的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2009(7):48-54.

[3] Naruszewicz M,Johansson M L,Zapolska Downar D.Effect ofLactobacillusplantarum 299v on cardiovascular disease risk factors in smokers[J].American Journal of Clinical Nutrition,2002,52(6):1 249-1 255.

[4] Miettinen M,Vuopio Varkila J,Varkila K.Production of human tumor necrosis factor alpha,interleukin-6 and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria[J].Infect Immun,1996,64(12):5 403-5 404.

[5] 趙 雪,董詩竹,孫麗萍,等.海帶多糖清除氧自由基的活性及機(jī)理[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2011,35(4):531-538.

[6] GB 2760-1996，食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[7] 王嘉榕,騰 達(dá),田子罡,等.功能性抗氧化肽制備與機(jī)制研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(2):371-375.

[8] 惠翌昕.發(fā)酵羊乳產(chǎn)抗氧化肽乳桿菌的篩選及產(chǎn)肽條件優(yōu)化[D].西安:陜西科技大學(xué),2015.

[9] Bumsoo H,John C B.Direct cel1 injury associated with eutectic crystllization during freezing[J].Cryobiology,2004,48(23):8-21.

[10] Leslie S B,Israeli E,Lighthart B,et al.Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying[J].Applied and Environmental Microbiology,1995,61(10):3 592-3 597.

[11] 左 玉.自由基、活性氧與疾病[J].糧食與油脂,2011 (9):9-11.

[12] 程艷薇,譚書明.乳酸菌抗熱保護(hù)劑的優(yōu)化組合[J].中國調(diào)味品,2010,35(7):55-59.

[13] 曾海英,譚書明,母應(yīng)春,等.常壓干燥乳酸菌粉生產(chǎn)菌株高溫馴化及抗熱保護(hù)劑篩選[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(8):207-209.

[14] Zeng W C,Zhang Z,Gao H,et al.Characterization of antioxidant polysaccharides from auricularia auricular using microwave-assisted extraction[J].Carbohydrate Polymers,2012,89(2):694-700.

[15] Chauhan K.,U.Trivedi,K.C.Patel.Statistical screening of medium components by Plackett-Burman design for lactic acid production byLactobacillussp.KCP01 using date juice[J].Bioresource Technol,2007,98(32):98-103.

[16] 成妮妮.嗜酸乳桿菌抗熱保護(hù)劑的研究[J].食品研究與開發(fā),2003,24(6):51-53.

[17] 潘旭琳,張麗萍,張青孌,等.乳酸菌奶粉保護(hù)劑的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2005,17(4):79-82.

[18] 范 娜,陳雪峰.益生菌抗熱保護(hù)劑的研究[J].食品研究與開發(fā),2011,32(4):94-97.

【責(zé)任編輯：陳 佳】

Study on thermal protective agent ofLactobacilluscaseiby Plackett-Burman design

CHEN He, KOU Jian-bo, YANG Yan, ZHANG Ping, SHU Guo-wei

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Probiotics are the main functional factors of functional foods,andLactobacilluscaseiL61 has strong ability to produce antioxidant peptides.The effects of six kinds of heat-resistant protective agent on heat resistance ofLactobacilluscaseiL61 were investigated,and the viable cell number and antioxidant activity inLactobacilluscaseiL61 milk powder by spray drying were improved by Plackett-Burman design.The results showed that glycerol,skim milk and glucose had the most significant effect on survival ofLactobacilluscaseiL61.Therefore,these 3 substances were chosen as thermal protective agents ofLactobacilluscaseiL61,and the additive amount of the three kinds of protective agents was determined: skim milk 18 g/L,glucose 6%,glycerol 13 mL/L,which laid provided a technical basis for the preparation of high activityLactobacilluscaseimilk powder by spray drying.

thermal protective agent；LactobacilluscaseiL61； goat milk powder； antioxidant activity

2017-01-29

陜西省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(NYKJ-2015-004)

陳 合(1956-)，男，陜西咸陽人，教授，研究方向：食品生物技術(shù)與工程、功能性乳制品

2096-398X(2017)04-0122-04

TS201.3

A