不同宮內(nèi)缺氧時程對胎鼠腦組織STAT3表達的影響

陳滟++曹兵++王國棟++楊恩彬++叢樹園++陳普

【摘要】 目的：研究不同宮內(nèi)缺氧時間對胚胎大鼠腦組織信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3蛋白表達的影響。方法：制備乏氧性缺氧動物模型，從胎齡15d到16d連續(xù)宮內(nèi)缺氧2d，分別缺氧2、4、6、8、12h共5個不同時程，采用免疫組化檢測胚胎大鼠腦組織STAT3蛋白表達情況。結(jié)果：與對照組比較，缺氧2h胎鼠腦組織STAT3蛋白表達升高（P<0.05），在缺氧6h達最高（P<0.05）；缺氧8h較對照組染色增強，但較缺氧6h表達減弱（P<0.05）；缺氧12h組與對照組相比STAT3表達降低（P<0.05）。結(jié)論：短時缺氧（缺氧2、4、6、8h）能增強胎鼠腦組織STAT3蛋白的表達，但缺氧時間較長（缺氧12h）會降低STAT3蛋白的表達，說明宮內(nèi)缺氧對胚胎腦組織的影響可能通過STAT3通路進行調(diào)節(jié)。

【關(guān)鍵詞】 STAT3；缺氧；胚胎；腦組織

【中圖分類號】R693

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517（2015）24-0013-03

胎兒窘迫是胎兒宮內(nèi)缺氧危及胎兒健康和生命的綜合征，常發(fā)生在臨產(chǎn)或妊娠后期，是未生兒死亡的主要原因。神經(jīng)組織對缺氧較為敏感，胎兒窘迫可引起嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal trnasducer andaetivator of tnarscription 3，STArI3）參與多種基因的表達和調(diào)控，并與其他轉(zhuǎn)錄因子一起形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與到胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程。在局部腦缺血再灌注的研究中發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧可激活神經(jīng)元STAT3的表達。陳良萬等研究缺血性腦損傷發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)JAK2-STAl3可以減輕腦損傷。研究觀察宮內(nèi)不同缺氧時間對胚胎神經(jīng)組織STArl3蛋白表達的影響，以探討STArI3在胎兒窘迫腦損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑云南系健康成年雌性SD大鼠30只（體重250～300g），由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。STAT3免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

1.2 儀器泵吸式紅外二氧化碳檢測儀；J280 -二氧化碳檢測儀；奧林巴士顯微鏡。

1.3 動物模型的建立將30只成年雌性大鼠分別與雄鼠配種，于第二日早晨發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓記為妊娠Od，至孕15d。將孕鼠隨機分為：對照組、缺氧2h組、缺氧4h組、缺氧6h組、缺氧8h組、缺氧12h組，每組各5只（每只孕鼠可得胎鼠5-8只，每小組均隨機選10只胎鼠）。將缺氧組各孕鼠放入裝有300ng石灰（可吸收C0₂）的4000ml容量的玻璃缸內(nèi)，密閉瓶蓋（廣口瓶下端通過活塞連接氧氣袋，活塞與氧氣袋之間有約50ml容量的小氣囊）。玻璃缸內(nèi)還連接有測氧儀，使缸內(nèi)02濃度維持在10%～11%。當0₂濃度降低時，通過活塞將小氣囊中氧氣緩慢擠壓入玻璃缸內(nèi)，維持0₂濃度恒定。如此反復(fù)，直至孕鼠持續(xù)低張性缺氧達所需時程取出。孕16d相同操作至缺氧時間，取出復(fù)氧2h。然后將各孕鼠脫頸處死，快速剖腹取出胎鼠，取胎鼠腦放入10%甲醛固定。對照組孕鼠不缺氧直接取胎鼠腦組織固定。

1.4 免疫組化每組每只孕鼠隨機選2只胎鼠腦組織作常規(guī)石蠟切片（冠狀切，片厚4μm）。選三張連續(xù)切片進行HE染色和免疫組化染色。顯微鏡下觀察、照相、圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)加減標準差（x+s）表示，采用￡檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微觀察情況 胎鼠腦組織STAT3免疫組織化學(xué)檢測陽性結(jié)果為細胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，主要分布在前腦泡和腦室的室管膜細胞；前腦泡分化為端腦的區(qū)域可見陽性實心細胞條帶，并在腦泡邊緣可見陽性神經(jīng)上皮細胞層；一些切片可在端腦內(nèi)見到陽性細胞呈團塊狀分布；眼泡也有陽性表達。由圖1-6可知，各組間STAT3的陽性表達差異較大。對照組室管膜細胞胞質(zhì)的STAT3陽性表達較弱，缺氧2h組STAT3的陽性表達較對照組顏色明顯增強；缺氧4h組陽性區(qū)域顏色與缺氧2h組差別不大，但面積增加；缺氧6h組STAT3的棕黃陽性結(jié)果最深，而缺氧8h組STAT3的陽性表達較缺氧6h組明顯下降，但與對照組比較差別不大；缺氧12h組幾乎沒有STAT3的表達。

2.2 觀密度值情況 由表1可知，與對照組比較，缺氧2h胎鼠腦組織STAT3蛋白表達升高（P<0.05），在缺氧6h達最高（P<0.05）；缺氧2h組和缺氧4h組STAT3的蛋白表達無組間差異；缺氧6h組比缺氧4h組STAT3的表達增強，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；缺氧8h較對照組染色增強，但較缺氧6h表達減弱（P<0.05）；缺氧12h組與對照組比較，STAT3表達降低（P<0.05）。

3 討論

星懿展在研究靶向STAT3基因干擾對小鼠神經(jīng)干細胞增值分化影響發(fā)現(xiàn)，抑制神經(jīng)干細胞中的STAT3基因可以降低神經(jīng)干細胞的增殖活性，提示STAT3參與與胚胎神經(jīng)干細胞的增殖分化。胎兒宮內(nèi)窘迫的神經(jīng)損傷與神經(jīng)干細胞的增殖和分化密切相關(guān)。本研究組早期研究官內(nèi)缺氧對胎鼠神經(jīng)干細胞的影響發(fā)現(xiàn)：宮內(nèi)缺氧3、6、9h能刺激神經(jīng)干細胞增殖，而宮內(nèi)缺氧12h減少神經(jīng)干細胞的數(shù)量。這與本實驗STAT3的變化呈現(xiàn)一致性，缺氧2h、4h、6h、8h能增強胎鼠腦組織STAT3蛋白的表達，但缺氧12h會降低STAT3蛋白的表達。提示官內(nèi)缺氧對胚胎神經(jīng)干細胞的影響可能通過調(diào)節(jié)STAT3通路發(fā)揮作用，但兩者的相關(guān)性還需要進一步的證實。哺乳動物大腦發(fā)育過程中，大腦皮質(zhì)、紋狀體、基底前腦區(qū)和海馬區(qū)均能檢測到STAT3的表達，且大量定位于巢蛋白（nestin）陽性的NSC中，與NSC的標記物Nestin呈現(xiàn)時空共表達性。STAT3表達的變化，除影響神經(jīng)干細胞的增殖，還會影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。在胚胎發(fā)育過程中，STAT3的激活能促進星形膠質(zhì)細胞的增殖。敲除STAT3能夠促使神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化，抑制其生成膠質(zhì)細胞的能力。然而，成年海馬區(qū)神經(jīng)元再生依賴于STArl3的激活，軸突損傷后STAT3的過表達激活可促進神經(jīng)元的再生。本研究為后續(xù)研究宮內(nèi)缺氧神經(jīng)組織STAT3變化與神經(jīng)干細胞的增殖、分化關(guān)系；與神經(jīng)元的變化關(guān)系；與神經(jīng)膠質(zhì)細胞的變化關(guān)系提供一定的研究思路。深入研究宮內(nèi)窘迫神經(jīng)損傷的STAT3分子作用機制，可加深對疾病的認識，為臨床治療提供新作用靶點，提供一定的研究基礎(chǔ)。