抗白粉病黃瓜葉微卷突變體的葉片結(jié)構(gòu)分析

戎福喜，秦亞光，陳菲帆，張朝文，趙子瑤，胡亮亮，李玉紅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院 陜西楊凌 712100）

抗白粉病黃瓜葉微卷突變體的葉片結(jié)構(gòu)分析

戎福喜，秦亞光，陳菲帆，張朝文，趙子瑤，胡亮亮，李玉紅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院 陜西楊凌 712100）

為了探討黃瓜卷葉突變體的葉片結(jié)構(gòu)與白粉病的抗性相關(guān)性，從植物抗性組織結(jié)構(gòu)角度，分別對突變體和野生型材料的葉片、柵欄組織、海綿組織、上下表皮的厚度、表皮毛密度及葉片蠟質(zhì)含量進(jìn)行了顯微形態(tài)觀察與檢測。結(jié)果表明，突變體的葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，葉片上、下表皮細(xì)胞增厚、柵欄組織變窄、海綿組織加厚且排列緊密；突變體表皮毛形態(tài)、數(shù)量無顯著差異；突變體葉片蠟質(zhì)含量顯著高于野生型。葉片蠟質(zhì)含量顯著增高可能是突變體對白粉病抗性增強(qiáng)的原因之一。

黃瓜；突變體；白粉??；抗性；葉片結(jié)構(gòu)

白粉病是黃瓜主要的真菌病害之一，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。噴施殺菌劑是目前最主要的防治方法，但會導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留及病原菌抗藥性增強(qiáng)等一系列問題[3],培育抗病品種是防治黃瓜白粉病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施[4]。而挖掘新的抗性資源、解析其抗性機(jī)制是培育抗病新品種的基礎(chǔ)和前提，不僅有助于加速抗病品種育種進(jìn)度，而且也為白粉病防治提供新的思路。

植物先天的形態(tài)結(jié)構(gòu)或經(jīng)病原菌誘導(dǎo)而產(chǎn)生的變異組織結(jié)構(gòu)是植物重要的物理抗病機(jī)制之一。前人研究發(fā)現(xiàn)植物的葉片表皮蠟質(zhì)層及形態(tài)結(jié)構(gòu)特征均與抗病性有關(guān)[5-8],如水稻葉片表面的蠟質(zhì)層阻礙了紋枯病病原菌的繁殖，抗病品種的葉片蠟質(zhì)含量明顯高于感病品種[9]；用氯仿除去油菜抗病品種葉表面蠟質(zhì)后，抗性品種變得易感病[10]；桉樹葉片的蠟質(zhì)層是抵抗和延遲病原菌侵入的最外層防線[11]；向日葵抗病品種葉片的柵欄組織排列整齊、緊密，而且層數(shù)相對較多，可以抵抗病菌的侵入和擴(kuò)展[12]；在瓜類作物上，抗病苦瓜品系葉片的蠟質(zhì)含量顯著高于感病品系，葉片、下表皮、柵欄組織均增厚，葉片結(jié)構(gòu)緊密度明顯高于感病品系，可以作為苦瓜白粉病抗性鑒定的參考指標(biāo)[13]。

由于白粉病抗性多為數(shù)量性狀且表型鑒定易受環(huán)境的影響，以致黃瓜白粉病抗性研究進(jìn)展緩慢。創(chuàng)制新種質(zhì)、解析其抗性機(jī)制，是推進(jìn)黃瓜白粉病抗性機(jī)制研究的另一個(gè)途徑和方法。課題組在創(chuàng)制的黃瓜EMS突變體庫中，篩選到一個(gè)葉微卷突變體‘C1561’，在白粉病的抗性方面與野生型差異極為明顯。前期的遺傳分析表明，突變體卷葉和白粉病的抗性性狀均受同一個(gè)顯性突變基因控制（暫時(shí)將其命名為PMrl），因此可用卷葉性狀作為標(biāo)記性狀來解析突變體對白粉病的抗性機(jī)制。為解析PMrl所導(dǎo)致的白粉病抗性與葉片組織結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，筆者以突變體‘C1561’和野生型‘CCMC’為材料，從葉片的蠟質(zhì)含量、上下表皮毛密度、葉片厚度等方面，對突變體和野生型的葉片組織結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分析，以期為后續(xù)的PMrl基因在白粉病抗性中的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的材料為葉微卷突變體‘C1561’和野生型‘CCMC’,其中突變體來自本課題組創(chuàng)制的EMS突變體庫，并經(jīng)過2代的自交篩選，性狀穩(wěn)定遺傳。突變體‘C1561’與野生型‘CCMC’對白粉病的抗性差異顯著（突變體‘C1561’的白粉病病情指數(shù)為 20.42±4.16，‘CCMC’的白粉病病情指數(shù)為50.60±12.73）。

1.2 方法

1.2.1 葉片組織結(jié)構(gòu)測定 在成株期，從長勢一致的突變體和野生型植株的第5片葉取樣，每片葉選取具有代表性的5個(gè)部位，每個(gè)材料各取5片葉，設(shè)置3次重復(fù)。組織觀察采用楊捷頻[14]的石蠟切片方法，取樣（樣品規(guī)格5 mm×7 mm）、固定（4℃、24 h）、整染（42℃、12 h）、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色（番紅-固綠）、封固、烘片，在BX-51型多功能顯微鏡下觀察并拍照。用測微尺測量葉片橫切面的厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度。葉片結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）、疏松度(SR)的計(jì)算，參考田麗波[13]等的方法。

CTR/%＝(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100；SR/%＝(海綿組織厚度/葉片厚度)×100。

1.2.2 表皮毛密度測定 應(yīng)用掃描電子顯微鏡對突變體、野生型植株葉片上、下表皮毛進(jìn)行觀察，樣品選取方法同1.2.1。常規(guī)掃描電鏡技術(shù)流程按照李波等[15]的方法略加修改，取樣（樣品規(guī)格5 mm×5 mm）、固定（4%戊二醛，2 h以上）、漂洗（pH 6.8，濃度0.1 mol·L-1，PBS 緩沖液浸洗 4 次，每次 10 min）、脫水（30%-50%-70%-80%-90%乙醇各1次，每次20min，100%乙醇3次，每次30 min）、中間液置換（酸異戊酯1次，20min）、干燥（真空）、粘臺、鍍膜、JSM-6360LV掃描電鏡觀察拍照。上、下表面各20個(gè)樣品，3次重復(fù)。

1.2.3 蠟質(zhì)含量測定 參照田麗波[13]的方法進(jìn)行蠟質(zhì)含量測定。各取10個(gè)葉片，3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

簡單數(shù)據(jù)處理整理軟件Excel，差異顯著性分析軟件SPSS 23.0，繪圖軟件GraphPad Prism 5。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體與野生型葉片橫切面顯微結(jié)構(gòu)特征分析

葉片組織排列緊密有利于抵制病原菌侵入。突變體與野生型的葉片橫切面顯微結(jié)構(gòu)顯示，突變體與野生型葉片橫切面結(jié)構(gòu)存在明顯差異，其葉片橫切面變窄，上、下表皮細(xì)胞加厚；柵欄組織變短，海綿組織變厚，細(xì)胞排列緊密（圖1）。

圖1 黃瓜突變體‘C1561’（A）與野生型‘CCMC’（B）的葉片橫切面結(jié)構(gòu)

對突變體與野生型的葉片、柵欄組織、海綿組織厚度進(jìn)行了測量（表1），結(jié)果表明，突變體葉片變薄，葉片厚度為 96.85 μm，而野生型為 123.10 μm，差異極顯著。在葉片上、下表皮厚度上，突變體均大于野生型，二者在下表皮厚度上差異顯著，其中野生型上、下表皮平均厚度分別為10.67、6.24 μm，突變體為13.08、8.06 μm。在柵欄組織、海綿組織上，突變體與野生型差異極為顯著，突變體柵欄組織和海綿組織均變小，野生型的柵欄組織、海綿組織的厚度分別為37.28、67.04 μm，突變體為20.66、55.06 μm。野生型柵欄組織、海綿組織占整個(gè)葉片橫切面的比例分別為30.28%、53.82%，突變體分別為21.43%、56.60%，與野生型相比，突變體葉片結(jié)構(gòu)緊密度降低、疏松度提高，緊密度差異極顯著。

表1 黃瓜突變體和野生型顯微結(jié)構(gòu)差異分析

2.2 野生型與突變體葉片表皮毛比較分析

由圖2和圖3可以看出，突變體與野生型在表皮毛形態(tài)上無顯著差異；在表皮毛數(shù)量上，野生型葉片正、背面表皮毛密度分別為3.9、7.4個(gè)·mm-2，而突變體為4.0、8.0個(gè)·mm-2，二者無顯著差異。

2.3 突變體與野生型葉片蠟質(zhì)含量比較分析

突變體‘C1561’葉片的蠟質(zhì)含量顯著增多，突變體葉片蠟質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.43 mg·g-1，而野生型葉片蠟質(zhì)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.90 mg·g-1，二者差異極顯著（圖4）。

圖2 突變體與野生型葉片表皮毛掃描電鏡觀察

圖3 黃瓜突變體和野生型葉片表皮毛密度差異分析

圖4 黃瓜突變體和野生型葉片蠟質(zhì)含量差異分析

3 討 論

植物在與病原菌相互作用、相互適應(yīng)的長期進(jìn)化過程中，形成了一套完整的自我防御結(jié)構(gòu)，如形成角質(zhì)層、蠟質(zhì)層、木栓層、氣孔、表皮毛、緊密排列的組織等。比較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，木栓層、角質(zhì)層厚，表皮毛密度大，氣孔密度小，葉片組織結(jié)構(gòu)緊密、排列整齊，細(xì)胞壁較厚，可能是抗白粉病的原因之一[16]。對苦瓜葉片結(jié)構(gòu)與抗白粉病關(guān)系的研究認(rèn)為，葉片厚度、柵欄組織厚度、下表皮厚度、葉片結(jié)構(gòu)緊密度與白粉病抗性呈正相關(guān)，而海綿組織厚度、葉片結(jié)構(gòu)疏松度與抗性呈負(fù)相關(guān)[13]。筆者對黃瓜突變體及野生型葉片橫切面顯微形態(tài)組織結(jié)構(gòu)觀察顯示，與野生型相比，突變體葉片柵欄組織、海綿組織結(jié)構(gòu)排列致密，上、下表皮細(xì)胞層均加厚。依此可以從組織結(jié)構(gòu)上解釋突變體增強(qiáng)了對白粉菌入侵的抵抗性。

葉表面蠟質(zhì)層是植物與外界環(huán)境直接的接觸面。真菌在葉表面附著與侵染時(shí)，表皮蠟質(zhì)層最先起到抵抗與延緩的作用，因此，蠟質(zhì)被認(rèn)為是植物抵抗生物及非生物逆境、自我防護(hù)的一道結(jié)構(gòu)屏障。在水稻[9]、番茄[17]、甘藍(lán)型油菜[10]等多種植物上均有相關(guān)報(bào)道。大部分研究結(jié)果都表明，植物蠟質(zhì)含量與抗病性呈正相關(guān)，抗病植株的葉片蠟質(zhì)含量顯著高于感病植株[18-19]；如蠟質(zhì)層有助于大豆延緩和抵抗灰斑病病原菌的入侵[20]；清除葉片蠟質(zhì)的甘藍(lán)型抗病油菜抗病性顯著減弱，由此認(rèn)為蠟質(zhì)的結(jié)構(gòu)及組分可能是產(chǎn)生抗病效應(yīng)的機(jī)制之一[10]；苦瓜蠟質(zhì)含量與白粉病抗性呈顯著正相關(guān)，葉片蠟質(zhì)含量越高的品系，對白粉病的抗性越強(qiáng)[13]。本研究中突變體葉片蠟質(zhì)含量顯著高于野生型，可能是由于基因突變而引起蠟質(zhì)含量或組成成分發(fā)生改變，從而對白粉病產(chǎn)生了一定的抗性。

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The leaf structure in cucumber slightly curly leaf mutant of resistance to powdery mildew

RONG Fuxi,QIN Yaguang,CHEN Feifan,ZHANG Chaowen,ZHAO Ziyao,HU Liangliang,LI Yuhong

(College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China)

To explore the relationship between the leaf structure of slightly curly leaf in cucumber mutant and resistance to powdery mildew,the mutant and wild cucumber material were observed and detected respectively from plant resistance organization structure.The indexes mainly included the leaf thickness,palisade tissue thickness,sponge tissue thickness,thickness of upper and lower epidermis,the density of trichomes and blade wax content.The results showed that the mutant leaf morphological structure changed significantly.The transverse section and palisade tissue of mutant leaf blade narrowed down,upper and lower epidermal cells were thicker,sponge tissue thicken and packed closely.There was no significant difference in the morphology and density of the mutant trichomes;the leaf wax content of the mutant is significantly higher than that of the wild type.These results suggested that higher wax content play an important role in resistance to powdery mildew.

Cucumber;Mutant;Powdery mildew;Resistance;Leaf structure

2016-11-11；

2017-02-10

國家自然科學(xué)基金(31071791;31471891)；高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(YQ2013003)；西北農(nóng)林科技大學(xué)國際科技合作基金項(xiàng)目

戎福喜，男，在讀博士研究生，主要從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究。E-mail:191186282@qq.com

李玉紅,女，教授,主要從事黃瓜種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究。E-mail:Liyuhong73@126.com.