卡介苗多糖核酸對被動吸煙小鼠肺組織、肺泡灌洗液、血清中NO及iNOS的影響

張正玲+張翊玲+唐立俊+錢正敏

摘要：目的 探討卡介苗多糖核酸（BCG-PSN）是否對被動吸煙小鼠的慢性氣道炎癥有保護(hù)作用。方法 將45只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三組：健康對照組、未治療對照組、卡介苗多糖核酸治療組。健康對照組不用任何處理，其余兩組每天進(jìn)行被動吸煙1次，連續(xù)30 d。治療組：卡介苗多糖核酸0.2 ml，隔1 d肌注1次，連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h內(nèi)將小鼠處死并收集標(biāo)本。結(jié)果 與未治療組比較，卡介苗多糖核酸治療組小鼠肺組織、血清及肺泡灌洗液中誘生型一氧化氮合酶（iNOS）與一氧化氮（NO）顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 卡介苗多糖核酸對被動吸煙小鼠的慢性炎癥具有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：卡介苗多糖核酸；小鼠；被動吸煙；一氧化氮；一氧化氮合酶

中圖分類號：R563.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）14-0047-03

Effects of BCG Polysaccharide Nucleic Acid on Lung Tissue，Bronchoalveolar Lavage Fluid，Serum NO and iNOS in Passive Smoking Mice

ZHANG Zheng-ling1，ZHANG Yi-ling2，TANG Li-jun1，QIAN Zheng-min1

（1.College of Life Science，Zunyi Normal University，Zunyi 563002，Guizhou，China；

2.Department of Respiratory Medicine，Guizhou Provincial People's Hospital，Guiyang 550002，Guizhou，China）

Abstract：Objective To investigate whether（BCG-PSN） has a protective effect on chronic airway inflammation in passive smoking mice.Methods 45 female C57BL/6 mice were randomly divided into three groups：healthy control group，untreated control group and BCG polysaccharide nucleic acid treatment group.Health control group without any treatment，the remaining two groups were passive smoking once a day for 30 d.Treatment group：BCG polysaccharide nucleic acid 0.2 ml，every 1 d intramuscular injection 1，for 30 d.Mice were sacrificed and samples were collected 24 h after the end of the experiment.Results Compared with the untreated group，the inducible nitric oxide synthase（iNOS）and nitric oxide（NO）were significantly decreased in lung tissue，serum and alveolar lavage fluid of BCG vaccine group（P<0.05）.Conclusion BCG polysaccharide nucleic acid has a protective effect on chronic inflammation in passive smoking mice.

Key words：BCG polysaccharide nucleic acid；Mice；Passive smoking；Nitric oxide；Nitric oxide synthase

一氧化氮（NO）在生理和病理過程中扮演不同的角色，正常水平的NO對降壓、擴(kuò)張血管、抗炎及抗凝等方面發(fā)揮重要的作用。然而，高水平的NO對機(jī)體會產(chǎn)生損害作用。誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的激活與炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、感染、休克、缺血、缺氧等刺激因素等密切相關(guān)。iNOS過度激活、引起大量的NO產(chǎn)生是機(jī)體損害的重要因素之一[1-3]。眾所周知，吸煙危害健康，煙霧中的尼古丁及焦油、煙堿和一氧化碳等有害物質(zhì)是慢性呼吸道疾病重要的致病因素或危險(xiǎn)因素，研究表明作為有害物質(zhì)的煙霧顆粒可間接或直接通過激活iNOS mRNA表達(dá)從而產(chǎn)生大量的NO損傷肺組織[4-6]。卡介苗多糖核酸（BCG-PSN）作為免疫調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于臨床，BCG-PSN是采用卡介苗經(jīng)熱酚法提取的多糖核酸類物質(zhì)，具有活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫功能[13-15]，有研究表明應(yīng)用BCG-PSN在預(yù)防和治療慢性支氣管炎、哮喘、肺癌、自身免疫性疾病等方面有較好療效，但BCG-PSN是否通過降低iNOS及NO方式來發(fā)揮保護(hù)作用的文章未見報(bào)道，本研究旨在于了解卡介苗多糖核酸是否會保護(hù)小鼠氣道慢性炎癥，是否會降低iNOS及NO的表達(dá)水平，并圍繞此目的而展開。

1資料與方法

1.1一般資料

6w齡雌性C57BL/6小鼠45只（購買于北京，SPF級），體質(zhì)量18～20 g，動物隨機(jī)分為三組：健康對照組、未治療對照組、卡介苗多糖核酸治療組。健康對照組不作任何處理，其余兩組進(jìn)行被動吸煙1次/d，應(yīng)用2根/次香煙形成煙霧（黃果樹牌香煙，焦油含量13 mg，由貴陽卷煙廠生產(chǎn)），由特制的玻璃裝置（35 cm×25 cm×15 cm，有香煙熏口與出口，保證香煙煙霧濃度均勻）進(jìn)行熏煙，燃10根/d香煙，1次/d，連續(xù)30 d?？ń槊缍嗵呛怂幔˙CG-PSN）由湖南九芝堂斯奇康生產(chǎn)。BCG-PSN治療組于吸煙4 h/d以前，用卡介苗多糖核酸0.2 ml，隔1 d肌注1次（每只小鼠大腿左右各肌注0.1 ml），實(shí)驗(yàn)時(shí)間為30 d（每只香煙焦油含量及牌子都固定不變）。被動吸煙時(shí)小鼠會出現(xiàn)呼吸頻率加快、腹式呼吸明顯，煩躁不安等癥狀。但30 d被動吸煙中未因?yàn)闊熿F吸入導(dǎo)致呼吸困難方面的死亡。

1.2標(biāo)本收集與處理

經(jīng)被動吸30 d后，于被動吸煙后的24 h內(nèi)將小鼠眼球取血處死，血清用于iNOS及NO檢測，其中8只小鼠肺組織部分應(yīng)用于病理活檢及部分應(yīng)用于勻漿后取上清液，-80℃保存?zhèn)錂z測；其余7只進(jìn)行雙側(cè)肺泡灌洗液，每次應(yīng)用1 ml PBS進(jìn)行灌注并每次反復(fù)抽吸3遍后回收，回收率達(dá)85%以上，每只小鼠灌注3次，并將3次回收的灌注液混合后離心并取上清液，并儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3染色

肺組織切片后行HE染色及PAS染色，血清及肺泡灌洗液、肺組織iNOS及NO檢測試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。操作嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。肺組織勻漿上清液的iNOS western Blot檢測抗體及β-actin抗體均購買于美國Santa cruz公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1小鼠肺組織切片進(jìn)行H&E染色

卡介苗多糖核酸治療能改善肺支氣管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤及血管滲出，減少肺泡水腫及肺間隔增厚、融合、斷裂等情況，通過病理檢測能直觀地反映BCG-PSN對支氣管哮喘的保護(hù)作用，見圖1。

2.2小鼠肺組織、肺泡灌洗液及血清中iNOS及NO表達(dá)情況

結(jié)果顯示，卡介苗多糖核酸治療組iNOS及NO表達(dá)水平顯著降低，見表1。