兼養(yǎng)小球藻在不同濃度Fe3+培養(yǎng)下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉彩霞, 顧文輝, 黃愛(ài)優(yōu), 3, 伍松翠, 張寶玉, 王廣策

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兼養(yǎng)小球藻在不同濃度Fe3+培養(yǎng)下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉彩霞1, 2, 顧文輝1, 黃愛(ài)優(yōu)1, 3, 伍松翠1, 2, 張寶玉1, 王廣策1

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 ; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心, 江蘇南通 226006)

為研究小球藻()對(duì)不同濃度Fe3+的響應(yīng), 測(cè)定了自養(yǎng)和乙酸兼養(yǎng)小球藻在不同濃度Fe3+條件下的生長(zhǎng)速率和油脂含量, 比較分析了兼養(yǎng)小球藻在不同濃度Fe3+下的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異。結(jié)果表明, 兼養(yǎng)小球藻比自養(yǎng)小球藻生長(zhǎng)速率快, 積累的生物量多, 在缺鐵條件下中性脂含量高。蛋白質(zhì)組分析顯示: 在缺鐵條件下光合作用相關(guān)蛋白含量最低; 在缺鐵和高濃度鐵條件下, 熱激蛋白、蛋白合成和糖代謝等過(guò)程相關(guān)蛋白表達(dá)都下調(diào), 表明缺鐵和高濃度鐵條件對(duì)小球藻的生長(zhǎng)都是逆境條件; 在缺鐵條件下氨基酸代謝相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào), 這可能是由于NO3–同化下降, 氨基酸合成減少, 需要進(jìn)行氮的回收利用。上述結(jié)果表明: 在兼養(yǎng)條件下缺鐵培養(yǎng)的小球藻可獲得較高生物量和中性脂含量; 而高濃度鐵能促進(jìn)小球藻生長(zhǎng), 但不能提高中性脂含量, 對(duì)藻細(xì)胞也有一定的脅迫效應(yīng)。

小球藻(); 兼養(yǎng); 乙酸鹽; 鐵離子; 蛋白質(zhì)組

石化燃料的短缺和溫室氣體CO2排放的增多, 迫使人們尋找新的可替代能源。在眾多新能源中, 生物能源具有來(lái)源廣泛、污染小、可再生性等優(yōu)點(diǎn), 應(yīng)用前景廣闊[1]。目前已發(fā)展作為生物能源的原料主要有谷物、菜油及微藻等。微藻具有生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量大、油脂含量高等特點(diǎn), 可以在遠(yuǎn)離農(nóng)場(chǎng)和森林的地方(如池塘、發(fā)酵罐, 甚至廢水)進(jìn)行培養(yǎng)[2], 不占用耕地, 對(duì)生態(tài)鏈和食物鏈的傷害小[3], 因而已逐漸成為生物燃油首選的原料。

微藻油脂含量是微藻生物柴油能否實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因子之一, 受營(yíng)養(yǎng)鹽等生長(zhǎng)條件的影響。已有報(bào)道, 氮缺乏[4-6]、磷限制[5-7]、高鹽[8]和重金屬脅迫[9]等條件均能促進(jìn)微藻油脂積累。然而, 這些因子在提高油脂含量的同時(shí)也限制了生物量的積累, 并不能有效提高油脂產(chǎn)量。必須尋求其他調(diào)控因子, 在提高油脂含量的同時(shí)又不限制、甚至能促進(jìn)生物量的積累。Behrenfeld等[10]證明鐵元素是影響浮游微藻生物量的關(guān)鍵因素; Liu等[11]發(fā)現(xiàn)在小球藻()指數(shù)生長(zhǎng)后期補(bǔ)加鐵離子可提高細(xì)胞終密度, 在初始培養(yǎng)基中添加一定濃度鐵離子可以促進(jìn)油脂積累。在此基礎(chǔ)上, 學(xué)者們對(duì)海洋微藻中的假微型海鏈藻[12]和某些淡水小球藻[13]、葡萄藻[14]、柵藻[15]等的研究中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果, 說(shuō)明鐵元素可以同時(shí)促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)和油脂的積累。

上述研究大多在自養(yǎng)條件下進(jìn)行, 在兼養(yǎng)條件下能否得到類(lèi)似的結(jié)果？有研究報(bào)道, 外加有機(jī)碳源(如乙酸鹽, 糖漿, 甘油等)兼養(yǎng)也可提高小球藻油脂含量[16-17]。那么, 兼養(yǎng)條件下提高培養(yǎng)基中Fe3+的濃度是否也會(huì)促進(jìn)小球藻油脂合成？作者以小球藻()為研究對(duì)象, 分別在自養(yǎng)和乙酸兼養(yǎng)條件下測(cè)定了不同濃度Fe3+對(duì)小球藻生長(zhǎng)和油脂含量的影響, 比較分析了不同濃度Fe3+兼養(yǎng)小球藻的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異, 以期從蛋白質(zhì)組角度對(duì)兼養(yǎng)條件下小球藻油脂積累途徑進(jìn)行解析, 為人工控制提高小球藻油脂含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)條件

研究所用小球藻()由本實(shí)驗(yàn)室保存。所用培養(yǎng)基為改良的BG-11培養(yǎng)基, 將原BG-11培養(yǎng)基[18]中的鐵用FeCl3代替檸檬酸鐵, 自養(yǎng)時(shí)所用碳源為Na2CO3, 兼養(yǎng)時(shí)所用碳源為乙酸鈉。所有培養(yǎng)均在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行, 光強(qiáng)為100 μmol/(m2·s),溫度為30℃, 光暗周期為12 h︰12 h(白天︰黑夜)。藻種分別在不含鐵的自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后, 2 000 g離心收集重新接種到不含鐵的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 d, 使其充分缺鐵。最后藻液離心收集后重新懸浮于5.4 L不含鐵的新鮮培養(yǎng)基中, 混勻, 初始接種濃度為 0.1 (682)。將混勻的藻液均分到9個(gè)1 L的三角瓶中, 根據(jù)Liu等[11]的Fe3+設(shè)置濃度和前期試驗(yàn), 將Fe3+濃度設(shè)置為0、10–6和10–5mol/L共3個(gè)處理, 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。每天定時(shí)搖瓶3次。

1.2 生長(zhǎng)測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)(UV-1800)測(cè)定682 nm處的吸光度來(lái)確定其生長(zhǎng)速率, 當(dāng)藻細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期時(shí), 2 000 g離心收集。

1.3 中性脂相對(duì)含量測(cè)定

中性脂的測(cè)定采用尼羅紅(Nile Red)染色, 熒光分光光度計(jì)(HITACHI F-4500)測(cè)定的方法[19-20]。在培養(yǎng)過(guò)程中, 每天定時(shí)取10 mL藻液, 根據(jù)值進(jìn)行濃縮或稀釋, 使其為0.1~0.8。取900 μL藻液, 加入100 μL二甲基亞砜(DMSO), 混勻, 30℃水浴處理10 min。取處理后的藻液980 μL, 加入20 μL尼羅紅染料(濃度為0.1 mg/mL丙酮), 染色1 min 30 s后測(cè)定570 nm處的熒光值, 激發(fā)光為480 nm。根據(jù)值與細(xì)胞數(shù)換算成百萬(wàn)細(xì)胞相對(duì)熒光值[20]。

1.4 總可溶性蛋白的提取

蛋白提取方法參照Wang等[21]的方法。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期以2 000 g離心收集藻液, 去除上清, 液氮速凍后取0.5 g鮮藻于研缽中研磨5 min, 研磨時(shí)加適量石英砂。加蛋白提取液15 mL, 4℃放置0.5~2 h, 每20 min搖晃一次; 8 000 g 4℃離心20 min, 去除沉淀, 上清加入4倍體積的10%(/)三氯乙酸(TCA)-丙酮, 內(nèi)含0.07%(/)β-巰基乙醇, 于–20℃靜置過(guò)夜。8 000 g 4℃離心20 min, 去除上清, 用丙酮沖洗蛋白沉淀4次以去除三氯乙酸, 放置在–20℃使殘留的丙酮揮發(fā)。蛋白粉末使用8 mol/L尿素(含125 mmol/L碳酸氫銨)在室溫下(約25℃)充分溶解。8 000 g 4℃離心10 min, 去除未溶解沉淀。上清使用3K超慮管(Amicon Ultra 0.5 mL, Milipore)在8 000 g 4℃離心20 min;添加8 mol/L尿素, 超濾3次。

1.5 蛋白質(zhì)定量和質(zhì)譜檢測(cè)

使用Solarbio BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Cat#PC0020)進(jìn)行蛋白定量, 以8 mol/L尿素稀釋, 使各樣品蛋白終濃度為1 mg/mL。蛋白樣品在37℃下用10 mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)還原1 h; 在黑暗條件下用50 mmol/L碘乙酰胺處理30 min, 進(jìn)行烷基化; 最后在37℃下用胰酶消化(胰酶︰蛋白為1︰30), 消化后的多肽用1%的甲酸酸化并貯存在–80℃, 以備LC-MS/MS檢測(cè)使用。質(zhì)譜檢測(cè)參照顧文輝的參數(shù)[22]。

2 結(jié)果

2.1 自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻在不同鐵離子濃度下的生長(zhǎng)速率

圖1顯示自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻都是在高濃度鐵(1.2×10–5mol/L)條件下生長(zhǎng)速率最快, 積累的生物量最多, 中濃度鐵時(shí)次之, 缺鐵(0 mol/L)時(shí)最慢。兼養(yǎng)條件下到達(dá)平臺(tái)期所需時(shí)間短, 積累的生物量多, 自養(yǎng)條件下到達(dá)平臺(tái)期所需時(shí)間長(zhǎng), 積累的生物量少。自養(yǎng)時(shí), 在中濃度鐵和高濃度鐵條件下小球藻生長(zhǎng)初期生長(zhǎng)速率幾乎一致, 到生長(zhǎng)后期高濃度鐵培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)速率比中濃度鐵濃度快, 20 d時(shí)缺鐵條件下小球藻生長(zhǎng)接近平臺(tái)期,約為0.8, 中濃度和高濃度鐵則還在生長(zhǎng)。兼養(yǎng)時(shí), 小球藻的生長(zhǎng)速率隨鐵離子濃度升高而加快, 缺鐵處理5 d到達(dá)平臺(tái)期,約為1.5, 高濃度鐵濃度培養(yǎng)條件下約9 d到達(dá)平臺(tái)期,約為3.0。與自養(yǎng)培養(yǎng)相比, 小球藻兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下在短時(shí)間內(nèi)積累了更多的生物量。

2.2 自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻在不同F(xiàn)e3+濃度下中性脂百萬(wàn)細(xì)胞熒光值

如圖2所示, 在缺鐵條件下, 自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移中性脂百萬(wàn)細(xì)胞相對(duì)熒光值逐漸上升, 隨后下降。自養(yǎng)時(shí), 小球藻在第6天百萬(wàn)細(xì)胞相對(duì)熒光值達(dá)到最高值, 兼養(yǎng)時(shí)一直處于較高水平, 在培養(yǎng)9 d后到最高值。中濃度鐵條件下, 自養(yǎng)時(shí)中性脂百萬(wàn)細(xì)胞熒光值一直接近于0; 兼養(yǎng)時(shí), 中性脂百萬(wàn)細(xì)胞熒光值隨培養(yǎng)時(shí)間增加先上升后下降, 在第3 d到達(dá)最高值, 最后下降, 到第7天幾乎降為0。高濃度鐵條件下, 自養(yǎng)時(shí)中性脂百萬(wàn)細(xì)胞熒光值一直接近于0, 兼養(yǎng)時(shí)小球藻的中性脂百萬(wàn)細(xì)胞熒光值隨培養(yǎng)時(shí)間的增加急劇下降, 培養(yǎng)5 d后基本降為0。

2.3 兼養(yǎng)蛋白質(zhì)組結(jié)果分析

由生長(zhǎng)速率和中性脂含量可以看出, 小球藻在兼養(yǎng)條件下能獲得較高的生物量和中性脂含量, 所以我們選取兼養(yǎng)的3組處理進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。

由表1可以看出, PS Ⅱ相關(guān)蛋白(CP47、CP43、D2、D1和PsaA)在中濃度鐵條件下表達(dá)量最高, 在缺鐵和高濃度鐵條件下表達(dá)量都有所下降。PS Ⅰ相關(guān)蛋白(PsaA和PsaB)在缺鐵時(shí)含量最低, 中濃度鐵和高濃度鐵時(shí)均高于缺鐵時(shí)含量, 二者表達(dá)量相差不大。ATP酶的α和β亞基在中濃度鐵條件下含量最低, 缺鐵時(shí)含量高于高濃度鐵條件。大部分卡爾文循環(huán)相關(guān)的酶(果糖二磷酸醛縮酶和核酮糖-5-磷酸激酶)隨著鐵離子濃度的升高而表達(dá)量增加。PS Ⅰ鐵硫中心(PsaC)蛋白含量、放氧復(fù)合物相關(guān)蛋白和細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體的b6和f蛋白含量都隨著鐵離子濃度的升高而升高。Fd-NADP氧化還原酶在缺鐵和高濃度鐵條件下含量較高, 缺鐵條件下的表達(dá)量高于高濃度鐵條件。儲(chǔ)鐵蛋白(ferrtin)在缺鐵和高濃度鐵時(shí)含量都較高。

碳代謝相關(guān)蛋白(主要是糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的幾種酶)包括磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶等的含量都是在中濃度鐵時(shí)最高。

氨基酸代謝相關(guān)酶和聚泛素在缺鐵時(shí)含量最高, 均高于中濃度鐵和高濃度鐵水平; 微管蛋白和組蛋白都是在缺鐵和高濃度鐵條件下含量高, 且缺鐵時(shí)含量比高濃度鐵時(shí)要高, 中濃度鐵時(shí)最低。HSP70B、超氧化物歧化酶和硫氧還蛋白樣蛋白在高濃度鐵時(shí)都含量最高。

3 討論

3.1 缺鐵限制小球藻生長(zhǎng)

由生長(zhǎng)曲線(圖1)可以看出缺鐵限制了小球藻的生長(zhǎng)。鐵元素是浮游植物生長(zhǎng)的必需元素, 存在于光合生物色素合成的相關(guān)酶中, 是光合作用和呼吸作用電子傳遞鏈的主要組成成分, 也作為氮素同化的輔助因子[23]。光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)因?yàn)楹F量高(3個(gè)4Fe-4S, 12Fe/PSⅠ), 成為鐵元素缺乏的主要靶標(biāo)[24], 同時(shí), 鐵作為PSⅡ和細(xì)胞色素b6/f等電子傳遞系統(tǒng)組分的輔助因子, 缺鐵也會(huì)引起其含量下降[25]。蛋白質(zhì)組結(jié)果顯示, 缺鐵條件下PSⅠ和PSⅡ的光合元件含量較低, 可能已經(jīng)降解, 光合電子傳遞受到影響, 光反應(yīng)在缺鐵條件下受到抑制。植物體內(nèi)硝酸鹽和亞硝酸鹽的還原需要鐵元素作為輔助因子[26], 缺鐵會(huì)抑制植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成[27], 氨基酸和蛋白代謝相關(guān)蛋白在缺鐵時(shí)表達(dá)量高于中濃度鐵組和高濃度鐵組, 可能是在缺鐵條件下NO3–同化下降, 氨基酸合成減少; 同時(shí), 蛋白的降解加快, 利于氨基酸的重新利用。微管蛋白和組蛋白在細(xì)胞分裂過(guò)程中起重要作用[28], 在缺鐵和高濃度鐵條件下含量都較高, 并且缺鐵時(shí)高于高濃度鐵的含量, 說(shuō)明在缺鐵條件下細(xì)胞合成更多的骨架蛋白和組蛋白以備在條件適宜時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)。

表1 通過(guò)LC-MS/MS鑒定的不同濃度鐵離子下的總可溶性蛋白的質(zhì)譜分析

Tab.1 Summary of the total soluble proteins identified by LC-MS/MS under different iron concentrations

3.2 兼養(yǎng)和缺鐵共同作用下獲得較高生物量和高油脂含量

有研究表明小球藻在兼養(yǎng)條件下, 生物量增加, 油脂含量提高[29]。小球藻在乙酸鹽兼養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速率快, 到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間短, 生物量高。

中性脂測(cè)定結(jié)果(圖2)顯示缺鐵條件下小球藻積累中性脂。藻細(xì)胞通過(guò)卡爾文循環(huán)固定CO2, 核酮糖-1, 5-二磷酸羧化/加氧酶是碳固定的限速酶, 雖然該酶不直接需要鐵元素, 但碳同化過(guò)程消耗來(lái)自光反應(yīng)的ATP和NADPH, 這些物質(zhì)的供應(yīng)受到鐵缺乏的影響, 在缺鐵條件下表達(dá)下調(diào)[25, 30], 導(dǎo)致光合固碳減少, 光合作用生成的有機(jī)物減少。鐵元素是硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的輔助因子, 在氮素的同化過(guò)程中有重要作用[26], 缺鐵時(shí)無(wú)法為植物生長(zhǎng)提供足夠的氮源, 而藻細(xì)胞仍可直接吸收乙酸鹽形成乙酰CoA, 多余的碳將進(jìn)行重新分配, 合成中性脂。中濃度鐵和高濃度鐵時(shí), 細(xì)胞有足夠的鐵合成各種含鐵元件, 此時(shí)細(xì)胞同化的碳多用于合成細(xì)胞必需的蛋白和多糖, 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速, 合成中性脂的量少。

在缺鐵的培養(yǎng)條件下, 自養(yǎng)和兼養(yǎng)的小球藻都積累中性脂, 但兼養(yǎng)時(shí)中性脂含量比自養(yǎng)時(shí)高很多, 生物量也比自養(yǎng)時(shí)高。所以, 兼養(yǎng)和缺鐵共同作用下可獲得較高的生物量和油脂含量。

3.3 高濃度鐵促進(jìn)生長(zhǎng), 但對(duì)細(xì)胞有一定的脅迫作用

高濃度鐵條件下生長(zhǎng)速率最大。高濃度鐵下, 藻體合成大量光合相關(guān)蛋白和酶, 光反應(yīng)加快, 生成的ATP和NADPH增多, 卡爾文循環(huán)相關(guān)酶表達(dá)量隨著鐵離子濃度升高而上升, 加速了碳固定速率。鐵元素是很多生物過(guò)程的必需組分, 但鐵離子濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生大量活性氧[31], 對(duì)細(xì)胞光合膜造成氧化傷害[32], 蛋白質(zhì)指結(jié)果顯示PS Ⅱ光合蛋白含量下降, 說(shuō)明高濃度鐵離子對(duì)PS Ⅱ光合膜影響顯著, 但PS Ⅰ對(duì)此似乎并不敏感, 無(wú)明顯下降。生物有多種降低活性氧, 保護(hù)自身免受毒害的方式, 包括形成抗氧化分子(如谷胱甘肽、抗壞血酸、生育酚和類(lèi)胡蘿卜素)和抗氧化酶(SOD、CAT和APOX)以保護(hù)植物免受氧化傷害[33]。高濃度鐵條件下, 與抗氧化相關(guān)的蛋白(熱激蛋白和超氧化物歧化酶)表達(dá)量最高, 說(shuō)明高濃度鐵對(duì)小球藻造成氧化脅迫, 藻體合成更多抗氧化物質(zhì)進(jìn)行自我保護(hù), 免受氧化傷害。葉綠素本身不含鐵, 但合成葉綠素的部分酶需要鐵元素作為輔助因子[34], 葉綠素合成的相關(guān)酶(谷氨酸半醛氨基轉(zhuǎn)移酶)變化趨勢(shì)與光系統(tǒng)的變化趨勢(shì)一致, 在缺鐵時(shí)表達(dá)最低, 在中濃度鐵時(shí)表達(dá)最高, 高濃度鐵時(shí)比中濃度鐵時(shí)略有下調(diào), 說(shuō)明葉綠素的合成與光系統(tǒng)蛋白含量是正相關(guān)的。

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(本文編輯: 梁德海)

Proteomic analysis of mixotrophic cultivation ofexposed to different iron concentrations

LIU Cai-xia1, 2, GU Wen-hui1, HUANG Ai-you1, 3, WU Song-cui1, 2, ZHANG Bao-yu1, WANG Guang-ce1

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3.Nantong Branch, Institute of Oceanology, Chinese, Academy of Sciences, Nantong 226006, China)

Here, we investigated the effect of different iron concentrations on the growth rate and lipid content of autotrophic and mixotrophic cultivations of. Differential expression of proteins in mixotrophicexposed to different iron concentrations was analyzed. The results showed that mixotrophic cultivation demonstrated a faster growth rate and improved biomass than autotrophic cultivation. Iron deficiency may result in an increase in the lipid content. Proteomics analysis showed that the concentration of iron-containing proteins involved in photosynthesis was low in an iron-deficient culture condition. Hot shock proteins as well as proteins involved in translation and glycolysis were downregulated under both low and high iron concentrations, indicating that these growth conditions were stressful for. The concentration of proteins involved in amino acid metabolism increased under iron-deficient conditions, possibly due to downregulation of NO3?assimilation and amino acid synthesis. These results showed that both the growth rate and lipid content in mixotrophicwere higher under iron-deficient conditions. The growth ofwas accelerated under conditions of high iron concentrations, without affecting its lipid content. These results imply that high iron concentrations lead to a stress effect on the cells of.

; mixotrophic; acetate; Fe3+; proteomics

Jun. 11, 2016

[International S & T Cooperation Program of China (2015DFG32160), Ministry of Science and Technology of PRC fundamental research work (2012FY112900-01); Nantong Science and Technology Planning Project 2014 (AS2014007); Postdoctoral Innovation Project Special Funds of Shandong Province (2014)]

Q949.21

A

1000-3096(2017)03-0001-07

10.11759/hykx20160330001

2016-06-11;

2016-10-03-08

科技部國(guó)際合作專(zhuān)項(xiàng)(2015DFG32160); 科技部國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)(2012FY112900-01); 南通市2014年科技計(jì)劃項(xiàng)目(AS2014007); 山東省博士后創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2014)

劉彩霞(1989-), 女, 山東青島人, 碩士研究生, 從事藻類(lèi)分子生理學(xué)與發(fā)育調(diào)控研究, 電話: 0523-82898575, E-mail: caixliu@126.com; 張寶玉, 通信作者, 副研究員, 電話: 0532-82898923, E-mail: by-zhang@163.com; 王廣策, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-82898574, E-mail: gcwang@qdio.ac.cn