新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其抑制劑研究進(jìn)展

胡建平， 左 柯， 萬 華

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 數(shù)學(xué)與信息學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

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新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其抑制劑研究進(jìn)展

胡建平1，2， 左 柯1，2， 萬 華3

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 數(shù)學(xué)與信息學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

β-內(nèi)酰胺類抗生素，作為一線抗生素被廣泛用于各類細(xì)菌感染的臨床治療.由位于質(zhì)粒的基因blaNDM-1編碼的新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1可高效水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的應(yīng)用造成了極大的威脅，開發(fā)有效的抑制劑新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1抑制劑迫在眉睫.而抑制劑分子的設(shè)計(jì)改造工作的開展有賴于對(duì)新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1結(jié)構(gòu)和催化功能的研究，本綜述旨在總結(jié)目前有關(guān)新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其抑制劑的相關(guān)研究進(jìn)展，為基于新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計(jì)、改造等研究提供幫助.

細(xì)菌耐藥；NDM-1；催化機(jī)理；抑制劑；藥物設(shè)計(jì)

0 引 言

自1929年，人類發(fā)現(xiàn)第一種抗生素——青霉素以來，抗生素已挽救了無數(shù)的生命.目前，以青霉素和頭孢菌素為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素，是治療細(xì)菌感染的常用藥物，該類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有一個(gè)發(fā)揮藥效必需的四元β-內(nèi)酰胺環(huán)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.當(dāng)其作用于細(xì)菌時(shí)，β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)，與細(xì)菌細(xì)胞壁合成途徑中的羧肽酶和轉(zhuǎn)肽酶發(fā)生?；饔?，抑制該酶的生物活性而使合成的細(xì)胞壁出現(xiàn)缺陷，最終導(dǎo)致菌體裂解死亡[1-2].

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥問題也日益凸顯[3]，同時(shí)攜帶多種耐藥基因的“超級(jí)細(xì)菌"，如泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等也頻頻被報(bào)道[4-6].在細(xì)菌耐藥機(jī)制中，產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶滅活抗菌藥物最為常見，而β-內(nèi)酰胺酶是一種可催化β-內(nèi)酰胺環(huán)水解開環(huán)的水解酶.基于氨基酸序列的同源性[7]，β-內(nèi)酰胺酶可分為A、B、C和D 4類.其中，A、C和D類酶的活性位點(diǎn)為絲氨酸殘基，故又統(tǒng)稱為絲氨酸-β-內(nèi)酰胺酶(serine-β-lactamase,SBL)；而B類酶則依靠1個(gè)或2個(gè)金屬離子行使催化功能，因此又稱為金屬-β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase,MBL),具體可細(xì)分為B1、B2和B3 3個(gè)亞類.

圖1 β-內(nèi)酰胺類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)是一種廣譜高效的B1 MBL，于2009年首次被報(bào)道[8-9].目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)同類的另外14個(gè)變種[10]，依次命名為NDM-2～NDM-15.NDM-1由位于質(zhì)粒的blaNDM-1基因編碼，可水解除氨曲南和美西林外幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素[8，10-11].研究發(fā)現(xiàn)，blaNDM-1基因并不僅限于在醫(yī)院獲得性菌種間傳遞，同時(shí)也可在社區(qū)高度流行的菌種間傳播[12-13]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近10種細(xì)菌表達(dá)NDM-1[14].這些表達(dá)NDM-1的細(xì)菌可引起包括尿道和肺部感染、腹膜炎、軟組織感染及敗血癥等疾病，為相關(guān)病癥的臨床治療造成了嚴(yán)重威脅.

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，比如，改良Hodge試驗(yàn)[15-16]和基于顯色培養(yǎng)基篩選法[17-19]等表型方法，基于PCR的體外蛋白表達(dá)技術(shù)[20]、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法[21-22]等基因型方法，以及分子方法均可有效檢測出產(chǎn)NDM-1的菌株.同時(shí)，在治療方面，雖然有報(bào)道聯(lián)用多種抗菌藥物并口服磷霉素成功治愈產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌引發(fā)的尿道感染的個(gè)案[23]，但目前仍缺乏對(duì)產(chǎn)NDM-1菌株特效的治療藥物.

考慮到β-內(nèi)酰胺類抗生素良好的藥效和較低的毒副作用，開發(fā)有效的NDM-1抑制劑并與β-內(nèi)酰胺類抗生素配伍使用是目前主要的研發(fā)思路.而掌握NDM-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理等生物化學(xué)信息，可為其抑制劑的設(shè)計(jì)、改造等提供有力的技術(shù)支撐.

1 NDM-1的分子結(jié)構(gòu)

獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)是NDM-1發(fā)揮水解功能的基礎(chǔ)，同時(shí)也是篩選、設(shè)計(jì)抑制劑的重要依據(jù).截至2017年3月，RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)共收錄了30個(gè)NDM-1晶體結(jié)構(gòu)，除3S0Z(PDB ID)為大腸桿菌NDM-1外，其余均來自肺炎克雷伯菌.NDM-1為雙金屬M(fèi)BL[24-27]，在30個(gè)NDM-1晶體結(jié)構(gòu)中，活性口袋中含有金屬離子的結(jié)構(gòu)有23個(gè)(3SFD為單鋅離子結(jié)構(gòu))，同時(shí)結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)構(gòu)縮為14個(gè)，其中結(jié)合抑制劑的結(jié)構(gòu)有3個(gè)(5A5Z、4U4L、4EXS).表1列出了NDM-1-底物/抑制劑復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的具體信息.

表1 NDM-1-底物/抑制劑復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)信息

1.1 NDM-1的整體結(jié)構(gòu)

NDM-1由單多肽鏈構(gòu)成，共含有270個(gè)氨基酸殘基，呈典型的αβ/βα夾層結(jié)構(gòu)[28-30]，具體如圖2所示.

圖2 NDM-1的整體結(jié)構(gòu)

從圖2中可以看出，分子暴露在溶劑中的兩側(cè)分別為2段α螺旋，從N端往C端依次為α1、α2、α5和α6；2個(gè)β折疊通過一段α-β-α的結(jié)構(gòu)相連接位于分子的內(nèi)層.其中，靠近N端的β折疊由7股平行或反平行的β折疊片構(gòu)成，而靠近C端的β折疊則由4股組成[26].3段loop區(qū)L3(L65-V73)、L7(T119～M126)和L10(C208～L221)組成了活性口袋的主體部分，具有催化活性的2個(gè)Zn2+(Zn1與Zn2)則位于口袋底部[31].

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌體內(nèi)，NDM-1以單體形式發(fā)揮催化活性[31]，而目前解析得到的NDM-1晶體結(jié)構(gòu)則多為二聚體，其在膜結(jié)合與純化狀態(tài)下能通過疏水與范德華相互作用進(jìn)行二聚被推測與該酶獨(dú)特的耐藥機(jī)制有關(guān)[28].

1.2 NDM-1的活性位點(diǎn)

圖3給出了NDM-1活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)：位于活性中心的Zn1與H120、H122、H189及水分子/OH-(與晶體生長時(shí)的pH有關(guān)[27,35])結(jié)合構(gòu)成四面體構(gòu)型，即組氨酸位點(diǎn)；Zn2與D124、C208和H250結(jié)合構(gòu)成三角錐形結(jié)構(gòu)形成半胱氨酸位點(diǎn)；Zn1與Zn2通過D124的側(cè)鏈相聯(lián)系[26,30-31].

圖3 NDM-1活性位點(diǎn)的局部放大圖

從圖3可以看出，Zn1與水解后的苯唑西林(oxacillin,OXA)的β-羧基間存在相互作用，Zn2還與噻唑環(huán)上的N和羧基配位結(jié)合，提示Zn2+在NDM-1與底物的結(jié)合和催化水解反應(yīng)的過程中均具有重要作用.Zn2+與底物間的這種相互作用，使β-內(nèi)酰胺環(huán)維持在易被進(jìn)攻的空間取向狀態(tài)，從而使得水解反應(yīng)得以高效進(jìn)行[36].晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，Zn2+可以被其他金屬離子，如Cd2+、Mn2+、Co2+等，替換[30].

Yang等[37]測定了野生型NDM-1和Zn/Co、Co/Co和Co/Cd 3種金屬離子替換后的NDM-1水解chromacef的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以及紫外—可見光光譜(UV-vis)、核磁共振氫譜(1H NMR)、電子順磁共振譜(EPR)、X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)譜(EXAFS)等數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：金屬替換后，NDM-1的酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)出現(xiàn)明顯變化，具有順磁性的金屬取代NDM-1，比如Co/Cd和Zn/Co，與底物反應(yīng)時(shí)有顯著的結(jié)構(gòu)變化；與其他B1 MBLs相比，NDM-1的活性位點(diǎn)擁有更大的表面積，這顯然與構(gòu)成活性位點(diǎn)的L3和L10均距離鋅離子中心較遠(yuǎn)有關(guān)[28].Yuan等[38]通過分子對(duì)接預(yù)測了160種β-內(nèi)酰胺類抗生素在NDM-1活性位點(diǎn)處的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)NDM-1在結(jié)合底物后，其活性位點(diǎn)構(gòu)象并未出現(xiàn)較為顯著的變化.這為NDM-1水解底物的廣譜性提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).

此外，科研人員對(duì)活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)分析還發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵識(shí)別殘基，例如：K125通過與周圍殘基形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定L7的構(gòu)象，同時(shí)對(duì)與Zn1結(jié)合的殘基有一定的空間位阻排斥效應(yīng)[27]；Y229對(duì)穩(wěn)定活性位點(diǎn)的構(gòu)象同樣具有重要意義[27,31]；定點(diǎn)突變L65A導(dǎo)致氨芐西林和一些頭孢菌素的最低抑菌濃度下降，而定點(diǎn)突變N220A則導(dǎo)致NDM-1對(duì)氨芐西林、頭孢吡肟、美羅培南和亞胺培南的水解能力大大降低[39].Zhu等[40]對(duì)NDM-1與氨芐西林、頭孢硝噻吩和美羅培南形成的3個(gè)復(fù)合物體系進(jìn)行了30 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，位于L3上的L65、M67和F70均與氨芐西林和頭孢硝噻吩的側(cè)鏈形成了較強(qiáng)的疏水作用，此對(duì)于維持復(fù)合物的穩(wěn)定性具有重要意義，并給出了L3在整個(gè)模擬過程中具有3簇主要構(gòu)象，并呈現(xiàn)出較大的片段柔性.相關(guān)研究表明：Q123與D124側(cè)鏈的氧原子可與臨近的β內(nèi)酰胺類抗生素側(cè)鏈形成氫鍵[27]；K211、G219、N220與H189在IMP-1、CcrA等同類MBLs中高度保守，K211除了參與底物的識(shí)別與水解反應(yīng)外，還可通過與底物形成鹽鍵維持其有利于水解反應(yīng)的正確取向；N220可與底物的羰基氧原子形成氫鍵，還可與Zn1形成相互作用，后者可能與維持水解反應(yīng)中的四面體中間產(chǎn)物的穩(wěn)定有關(guān)[26-28,39,41].

2 NDM-1的催化機(jī)理

作為B1類MBL成員之一，NDM-1催化底物水解的機(jī)理與同類MBLs類似[27]，主要包括，β-內(nèi)酰胺羰基與Zn1結(jié)合，OH-的親核進(jìn)攻，質(zhì)子向N原子的轉(zhuǎn)移和C-N鍵的斷裂，具體如圖4所示.但其水解機(jī)理中的具體細(xì)節(jié)尚未被全部闡明，還有待進(jìn)一步的探究.

A表示青霉素類β-內(nèi)酰胺類抗生素時(shí)可能的水解途徑；B表示頭孢菌素類β-內(nèi)酰胺類抗生素時(shí)可能的水解途徑；C表示碳青霉烯類β-內(nèi)酰胺類抗生素時(shí)可能的水解途徑.E表示NDM-1，S表示底物，I表示中間體，P表示產(chǎn)物，W表示水.機(jī)理的繪制參考文獻(xiàn)[37,42,45].

圖4 NDM-1可能的催化機(jī)理

關(guān)于反應(yīng)中的親核試劑和廣義堿，有學(xué)者認(rèn)為，溶劑環(huán)境中的水分子在水解反應(yīng)中作為親核試劑，而位于活性位點(diǎn)中的OH-作為廣義堿，溶劑環(huán)境中的水分子向OH-給出質(zhì)子后生成新的OH-，然后進(jìn)攻β-內(nèi)酰胺環(huán)的羰基碳原子，該反應(yīng)的發(fā)生需要越過約80 kJ/mol的能壘[27，35]；也有學(xué)者認(rèn)為，親核試劑可能是位于活性位點(diǎn)的水分子，而D124或環(huán)境中的水分子作為廣義堿接受質(zhì)子，該情況下的反應(yīng)能壘大于或等于200 kJ/mol[42].

有學(xué)者認(rèn)為，按照其他MBLs的反應(yīng)機(jī)理，位于Zn1和Zn2間的OH-作為親核試劑進(jìn)攻β-內(nèi)酰胺環(huán)后，C-N鍵可立即斷裂形成氮負(fù)離子中間體[43].但Zhang等[42]提出，β-內(nèi)酰胺環(huán)受到OH-進(jìn)攻后，C-N鍵的斷裂可能與負(fù)離子的質(zhì)子化反應(yīng)協(xié)同進(jìn)行，并不產(chǎn)生氮負(fù)離子中間體.但無論是上述哪種情況，氮原子上的質(zhì)子均來自親核進(jìn)攻的OH-.而科研人員在NDM-1Δ6、NDM-1Δ21和NDM-1Δ36(分別表示移除分子的前6、21和36個(gè)氨基酸)的酶促動(dòng)力學(xué)研究過程中發(fā)現(xiàn)，NDM-1的催化機(jī)理中可能存在不只一個(gè)中間體[44].在探究NDM-1對(duì)頭孢菌素類β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解機(jī)制中，F(xiàn)eng等[25]通過1H NMR監(jiān)測到了二氫噻嗪環(huán)中雙鍵轉(zhuǎn)移的情況，最終質(zhì)子并不是轉(zhuǎn)移至N原子，而是根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)遷移至不同的部位，并得到了反應(yīng)中間體的晶體結(jié)構(gòu).

此外，研究人員在對(duì)金屬取代NDM-1催化機(jī)理的研究中還發(fā)現(xiàn)：金屬離子的種類并不能顯著影響反應(yīng)的能壘；產(chǎn)物的釋放速率與半胱氨酸位點(diǎn)的金屬路易斯酸性大小有關(guān)(Zn>Co>Cd)，但同時(shí)也受到組氨酸位點(diǎn)處金屬種類的影響；當(dāng)用Co2+離子取代Zn1時(shí)，生成產(chǎn)物的速率比未取代時(shí)快2～3倍，這可能與Co2+離子改變了與底物反應(yīng)時(shí)的電子結(jié)構(gòu)，降低了電子結(jié)構(gòu)對(duì)稱性有關(guān)；當(dāng)用Cd2+離子取代Zn2時(shí)，中間體的生成速率有明顯影響，提示Zn2在親核進(jìn)攻和穩(wěn)定中間體的過程中具有重要意義[37].

目前，分子動(dòng)力學(xué)模擬和混合量子力學(xué)/分子力學(xué)模擬等理論研究方法在酶催化反應(yīng)的機(jī)理研究中應(yīng)用廣泛.Zheng等[42]使用SCC-DFTB/CHARMM混合力場模擬了NDM-1與底物氨芐西林和抑制劑L-卡托普利的結(jié)合模式，并根據(jù)密度泛函理論對(duì)氨芐西林的開環(huán)過程進(jìn)行了理論計(jì)算，模擬結(jié)果顯示：OH-位于兩個(gè)Zn2+的中間位置，并通過氫鍵與D124相連；氨芐西林的羧基并未與Zn2相連，而是通過氫鍵與K211和N220連接；后續(xù)OH-親核進(jìn)攻、C-N鍵斷裂、形成氮負(fù)離子中間體以及開環(huán)后羧基與Zn2配位鍵的形成幾乎同時(shí)進(jìn)行(見圖4).Zhu等[45]使用ONIOM算法對(duì)NDM-1催化美羅培南的水解機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，離子化的D124是C-N鍵斷裂的有利因素；在沒有水分子與Zn2結(jié)合時(shí)，反應(yīng)過程中更傾向于形成氮負(fù)離子中間體，且K211在底物結(jié)合和催化反應(yīng)的過程中均具有重要意義.由于NDM-1高效的水解速率，目前很難通過實(shí)驗(yàn)對(duì)理論計(jì)算得出的過渡態(tài)進(jìn)行驗(yàn)證.相關(guān)研究也表明，針對(duì)不同類型的底物NDM-1的催化機(jī)理各不相同.為了指導(dǎo)設(shè)計(jì)開發(fā)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抑制劑，NDM-1催化下的水解機(jī)理還有待在分子層面做進(jìn)一步探究.

3 NDM-1抑制劑的研究現(xiàn)狀

目前，科研人員為應(yīng)對(duì)NDM-1帶來的耐藥問題采取的主要策略為：在了解NDM-1結(jié)構(gòu)及可能水解機(jī)制的情況下，不斷開發(fā)或?qū)ふ也灰妆籒DM-1水解的新抗生素；篩選設(shè)計(jì)NDM-1抑制劑，并與傳統(tǒng)抗生素制成合劑.

3.1 含硫類抑制劑

硫元素是生命活動(dòng)中的重要元素之一，也常出現(xiàn)在各類藥物分子中.含硫類抑制劑的結(jié)構(gòu)式及IC50值如圖5所示.

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利中含有巰基結(jié)構(gòu)，是經(jīng)典的抗高血壓藥物.研究發(fā)現(xiàn)，D-卡托普利1對(duì)NDM-1表現(xiàn)出較好的抑制活性(IC50=7.9 μM)，而L-卡托普利的抑制活性相對(duì)較弱，其IC50為202.0 μM[31].Li等[46]為進(jìn)一步探究NDM-1抑制劑的藥效基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成并測試了系列D-卡托普利類似物2-6的抑制活性，發(fā)現(xiàn)R構(gòu)型的芐胺類似物6a表現(xiàn)出了較高的抑制活性，其IC50值為1.5 μM，遠(yuǎn)高于S型旋光異構(gòu)體.Shen等[47]發(fā)現(xiàn)噻吩羧酸類衍生物7-9對(duì)NDM-1具有一定的抑制作用，與美羅培南聯(lián)合給藥可提高美羅培南的抗菌活性.此外，Wang等[48]通過多步虛擬篩選從含有280萬個(gè)類藥分子的ZINC化合物庫中篩出3個(gè)磺胺類NDM-1抑制劑10-12，其分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，分子中的磺酰胺基直接與Zn1結(jié)合，從而阻礙水解反應(yīng)的發(fā)生，提示磺酰胺基可能是開發(fā)NDM-1抑制劑式可選的優(yōu)勢骨架結(jié)構(gòu).

3.2 苯并吡喃類抑制劑

苯并吡喃類NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖6所示.

利用分子對(duì)接方法，Proschak等[49]將SPECS數(shù)據(jù)庫中的分子對(duì)接至NDM-1等4種MBLs晶體結(jié)構(gòu)中.分子對(duì)接同時(shí)使用MOE、GOLD和PLANTS 3款軟件進(jìn)行，以3款軟件預(yù)測結(jié)合模式的均方根偏差小于或等于0.2 nm為判據(jù)進(jìn)行分子片段篩選；在篩得的分子片段中，僅保留MBLs中結(jié)合模式均方根偏差值小于或等于0.2 nm的片段進(jìn)行Fluorocillin試驗(yàn)評(píng)價(jià)活性，由此得到抑制活性最好的苯并吡喃類化合物13(IC50=50±9 μM)[50].此外，Gan等[51]還從青霉菌株(Penicillium sp. 109F 484)中分離得到2種具有微弱NDM-1抑制活性的聚酮化合物14和15，二者的IC50分別為94.9 μM和87.9 μM.抗菌實(shí)驗(yàn)顯示，化合物14和15對(duì)產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌均無抑制活性，與美羅培南聯(lián)合使用時(shí)，也無法提高美羅培南的抗菌活性.

圖5 含硫類NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)

圖6 苯并吡喃類NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)

3.3 共價(jià)結(jié)合型抑制劑

共價(jià)結(jié)合型NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖7所示.

研究發(fā)現(xiàn)，通過氫鍵、范德華等非鍵相互作用與靶點(diǎn)可逆性結(jié)合是大多數(shù)藥物在發(fā)揮藥效時(shí)與靶點(diǎn)的結(jié)合特點(diǎn)，但也不乏通過形成共價(jià)鍵與靶點(diǎn)不可逆結(jié)合的例子，如細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物.在NDM-1共價(jià)結(jié)合型抑制劑的開發(fā)過程中，Christopeit等[52]報(bào)道了2種可逆共價(jià)結(jié)合型非β-內(nèi)酰胺類抑制劑16(Kd=181 μM)和17(Ki=580 nM)，其電噴霧離子化質(zhì)譜和氨基酸定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)顯示，化合物16和17通過單鍵與NDM-1活性位點(diǎn)的K224結(jié)合；通過共價(jià)分子對(duì)接還發(fā)現(xiàn)，化合物17的酮羰基與Zn2之間存在極性相互作用，并與W87、I35和V67間形成輸水相互作用.Thomas等[53]通過高通量篩選也得到了2種共價(jià)結(jié)合型NDM-1抑制劑，對(duì)氯汞苯甲酸18和硝普鈉19，兩者的抑制活性(IC50)分別為2.3 μM和9.0 μM，通過質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測和C208D突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化合物18可以選擇性共價(jià)修飾NDM-1活性位點(diǎn)結(jié)合Zn2的C208，從而發(fā)揮抑制作用.另外，Thomas等[54]還報(bào)道了頭孢克洛20通過K211介導(dǎo)的多步反應(yīng)，不可逆地共價(jià)抑制NDM-1的活性(Ki=2.3±0.1 mM)，提示K211可能是開發(fā)共價(jià)結(jié)合型抑制劑的關(guān)鍵氨基酸殘基.依布硒啉21是一種新型非甾體抗炎藥，臨床上主要用于缺血和中風(fēng)的治療，研究發(fā)現(xiàn)：依布硒啉可與鍵合Zn2的C208形成S-Se鍵，從而影響NDM-1的催化功能；以(1.3～1.4)∶1的比例聯(lián)合使用依布硒啉和氨芐西林或美羅培南，可使得β-內(nèi)酰胺類抗生素的MICs分別下降4和35倍[55].

圖7 共價(jià)結(jié)合型NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)

3.4 金屬螯合劑

金屬離子作為NDM-1發(fā)揮催化功能的關(guān)鍵輔助因子，若使用金屬螯合劑封閉NDM-1活性位點(diǎn)的Zn2+，理論上可有效抑制其催化活性.典型NDM-1金屬螯合劑的結(jié)構(gòu)如圖8所示.

圖8 金屬螯合劑的結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，乙二胺四乙酸22是常見的金屬螯合劑，可有效抑制NDM-1(IC50=1.6 μM)，但由于其具有較強(qiáng)的毒性，并不適合直接用于臨床治療[56].Azumah等[57]評(píng)價(jià)了3種金屬螯合劑23～25在與美羅培南聯(lián)合使用時(shí)，NDM-1對(duì)美羅培南的耐藥情況：當(dāng)化合物23用量在4和8 mg/L時(shí)活性最佳，可使美羅培南的MICs分別降低至0.5和0.06 mg/L；化合物24在8和16 mg/L的劑量時(shí)，同樣也可將美羅培南的MICs分別降至1和0.125 mg/L；但化合物25對(duì)NDM-1的抑制效果較差，需要將用量提至32 mg/L才可將美羅培南的MICs降低至0.06 mg/L.此外，F(xiàn)alconer等[58]還報(bào)道了一類二氫吲哚螺噻二唑類金屬螯合劑26，并通過產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌小鼠感染模型證明了該類化合物對(duì)NDM-1的抑制活性，其單晶結(jié)構(gòu)顯示，原化合物26的S-Cspiro鍵斷裂，噻二唑環(huán)開環(huán)形成亞胺結(jié)構(gòu)，暴露的S與亞胺N構(gòu)成二齒配體與Zn2+進(jìn)行螯合，從而發(fā)揮抑制作用.

3.5 其 他

其他NDM-1抑制劑分子的結(jié)構(gòu)如圖9所示.

圖9 其他NDM-1抑制劑分子的結(jié)構(gòu)

曲霉明A 27是一種從雜色曲霉菌株中分離得到的一種天然產(chǎn)物.研究發(fā)現(xiàn)，曲霉明對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶均有良好的抑制作用，其IC50值分別為1.2 μM和3.4 μM[59-61].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，曲霉明對(duì)NDM-1的抑制作用同樣出色(IC50=4.0±1.0 μM)[62].研究人員利用電感耦合質(zhì)譜證實(shí)，曲霉明對(duì)NDM-1的抑制主要通過耗盡NDM-1活性位點(diǎn)中的Zn2+實(shí)現(xiàn)，屬于一種不可逆抑制作用，但這種抑制作用造成的失活狀態(tài)可通過加入過量的ZnSO4實(shí)現(xiàn)完全復(fù)活[62].雖然曲霉明在抑制活性和毒性等方面的表現(xiàn)令人滿意，但由于其較高的親水性，其藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步改善[62].Chrestopeit等[63]使用正交篩選聯(lián)合表面等離子共振技術(shù)得到了另外3種對(duì)NDM-1有一定抑制作用的片段分子28～30，其QM-polarized分子對(duì)接結(jié)果顯示：28～30的羧基可與Zn2結(jié)合，并與K224和N233形成氫鍵；28和30與W87、L59和V67間還存在一定的疏水作用.這些結(jié)合力可能是維持這些片段分子發(fā)揮抑制活性的關(guān)鍵因素.

4 展 望

產(chǎn)NDM-1的耐藥菌感染對(duì)使用β-內(nèi)酰胺類抗生素的臨床治療造成了嚴(yán)重威脅.自2009年首次報(bào)道NDM-1至今，各國學(xué)者已在NDM-1的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其抑制劑等領(lǐng)域開展了一系列研究，并基于不同底物提出了NDM-1多種可能的催化機(jī)理，但對(duì)于催化機(jī)理中的堿、親核試劑及中間體質(zhì)子化過程等具體細(xì)節(jié)仍在探討之中.就目前開發(fā)的抑制劑而言，抑制活性普遍維持在微摩爾級(jí)，雖在體外或體內(nèi)均取得了較為滿意的結(jié)果，但又由于分子固有的毒性或較差的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等，尚未能成功開發(fā)為藥物上市銷售.

隨著各學(xué)科的交叉融合及大數(shù)據(jù)時(shí)代的來臨，對(duì)NDM-1研究而言，根據(jù)量子或分子力學(xué)等理論，通過計(jì)算機(jī)模擬NDM-1的水解機(jī)理或其與抑制劑分子間的結(jié)合模式，并通過數(shù)學(xué)建模定量探究分子結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，為NDM-1抑制劑分子的設(shè)計(jì)與改造提供理論指導(dǎo)等已取得了一定的成效.隨著計(jì)算科學(xué)的飛速發(fā)展，模擬精度的逐步提高，藥學(xué)科研工作中計(jì)算機(jī)輔助的應(yīng)用將會(huì)越來越多，相信在不久的將來，基于理論的計(jì)算可望成為應(yīng)對(duì)諸如細(xì)菌耐藥問題等各類醫(yī)、藥學(xué)難題時(shí)不可缺少的主要工具之一.

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Advance Research on NDM-1:Structure,Catalytic Mechanism and Inhibitors

HUJianping1,2,ZUOKe1,2,WANHua3

(1.School of Pharmacy and Bioengineering，Chengdu University, Chengdu 610106, China;2.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University, Chengdu 610052, China;3.College of Mathematics and Informatics, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

As the first-line antibiotics,β-lactam antibiotics are widely used in the clinical treatment of various infections.New Delhi metallo-β-lactamase-1(NDM-1) encoded by gene blaNDM-1in plasmid DNA can hydrolyze nearly all kinds of β-lactam antibiotics,posing a critical threat to the application of β-lactamase.It is of great urgency to design novel NDM-1 inhibitors.The design and modification of inhibitor molecules are closely related to the research of both structural information and catalytic mechanism of NDM-1.In this review,structure,catalytic mechanism and inhibitors of NDM-1 all are summarized,which will be helpful for the design and modification of drug molecules targeting NDM-1.

antimicrobial resistance;NDM-1;catalytic mechanism;inhibitor;drug design

1004-5422(2017)02-0115-10

2017-03-02.

國家自然科學(xué)基金(31600591、 11247018)資助項(xiàng)目.

胡建平(1978 — )， 男， 博士， 教授， 從事計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)研究.

Q55；R915

A