豆象干標(biāo)本基因組DNA提取方法的改進(jìn)

李金慶 魯閩 粟智平 段效輝 王穎 孫超 盧經(jīng)

摘要[目的] 篩選豆象干標(biāo)本基因組DNA的有效提取方法。[方法] 以口岸截獲時間不等的豆象干標(biāo)本為材料，在傳統(tǒng)方法上加以改進(jìn)，對從干標(biāo)本中提取豆象基因組DNA的方法進(jìn)行了研究。將其所提取的基因組DNA的純度和濃度與CTAB法和SDS法進(jìn)行了比較，并對DNA進(jìn)行了完整性及PCR驗證。[結(jié)果] 與CTAB法和SDS法相比，豆象干標(biāo)本提取方法提取的DNA OD260/OD280值均在1.7～1.9，且濃度合適。DNA完整性及PCR驗證結(jié)果表明，豆象干標(biāo)本提取方法比較適合后續(xù)PCR試驗的開展。[結(jié)論] 豆象干標(biāo)本提取方法適合該研究中豆象干標(biāo)本基因組DNA的提取，可推廣到檢驗檢疫工作中截獲豆象的檢疫鑒定中，以縮短檢驗檢疫工作周期，提高檢驗檢疫工作準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞豆象干標(biāo)本；DNA提??；基因組DNA

中圖分類號S412文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0123-03

Abstract[Objective] To select the effective DNA extraction method for dried samples of bean weevil insects.[Method] The method for extracting genome DNA was studied on the basis of traditional methods by using dried bean weevil insects of different intercepted times as materials.The purity and concentration of the extracted genomic DNA samples were detected and compared with CTAB and SDS method， then the extracted genomic DNA samples were further verified by the DNA integrity and PCR identification.[Result] Compared with CTAB and SDS method， the extracted genomic DNA samples had appropriate OD260/OD280 values between 1.7-1.9 and appropriate concentrations. The DNA integrity and PCR identification results showed that the genomic DNA extraction method for dried bean weevil samples was more suitable for subsequent PCR experiments. [Conclusion] Dried bean weevil DNA extration method is suitable for extrating bean weevil insectsgenomic DNA. This method can be extended to the quarantine and identification of intercepted bean weevil samples in CIQ work， in order to shorten the period and improve the accuracy of CIQ work.

Key wordsDried bean weevil sample；DNA extraction；Genomic DNA

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)被大量應(yīng)用于檢驗檢疫工作中檢疫性昆蟲的鑒定等[1-5]，這些分子生物學(xué)鑒定技術(shù)快速有效，可有效彌補昆蟲形態(tài)學(xué)鑒定中早期形態(tài)（包括卵、幼蟲/若蟲、蛹）與殘缺蟲體難以辨認(rèn)、鑒定結(jié)果受主觀影響大、鑒定周期較長等缺點[6]。進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定時，昆蟲中有效基因組DNA的提取是鑒定成功與否的前提[7]。在以往的研究中，大多數(shù)研究者所用的昆蟲基因組DNA 提取材料基本上是新鮮樣品或超低溫冷凍標(biāo)本。但是在實際工作中，針對稀有類群或檢疫對象經(jīng)常面臨難以得到新鮮材料的問題，往往需要利用標(biāo)本館或從其他渠道得到的干標(biāo)本提取基因組DNA。由于干標(biāo)本的保存時間越長，基因組DNA的降解也就越嚴(yán)重，而且由于蟲體細(xì)胞嚴(yán)重脫水，給提取DNA帶來了很大難度[8-9]。因此，研究如何從昆蟲干標(biāo)本中提取基因組DNA，對于分子生物學(xué)鑒定昆蟲至關(guān)重要，決定著下游試驗的安全與成效。

傳統(tǒng)的昆蟲基因組DNA提取方法有CTAB提取法、SDS法以及商品化基因組DNA提取試劑盒等。由于試劑盒價格較高且適用范圍有限，因而其并不適合于每個實驗室，其他方法雖然能夠獲得質(zhì)量較高的DNA，但操作步驟較多，產(chǎn)率不是很高。且傳統(tǒng)的昆蟲基因組DNA提取前處理通常采用液氮研磨等方式，這種方法對于樣本的損耗較大。當(dāng)昆蟲頭數(shù)較少時，經(jīng)過液氮研磨處理已經(jīng)有了大量損耗，給后期DNA提取造成很大困難。尤其是在檢驗檢疫實際工作中，截獲的檢疫對象經(jīng)常是數(shù)量較少，而且還有保留標(biāo)本的要求，用液氮研磨等傳統(tǒng)方式，會造成樣本浪費和試驗效果不理想。筆者選用口岸中常截獲的檢疫性及常見重要豆象作為研究對象，對標(biāo)本的處理方式和基因組DNA的提取方法進(jìn)行改進(jìn)，并與傳統(tǒng)DNA提取方法——CTAB法、SDS法進(jìn)行對比，形成一套經(jīng)濟(jì)、高效的方法，為豆象進(jìn)行準(zhǔn)確分子鑒定提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料試驗所用豆象材料均為干制標(biāo)本，年份為5～25年不等，包括綠豆象（Callosobruchus chinensis L.）、鷹嘴豆象（Callosobruchus analis Fabricius）、四紋豆象（Callosobruchus maculates Fabricius）、菜豆象（Acanthoscelides obtectus Say）、花生豆象（Caryedon serratus Olivier）、巴西豆象（Zabrotes subfasciatus Boheman）、紫穗槐豆象（Acanthoscelides pallidipennis Motschusky）。試驗材料為煙臺出入境檢驗檢疫局多年來在口岸的截獲標(biāo)本，部分由中國檢驗檢疫科學(xué)院（北京）植物檢疫所提供。

1.2豆象干標(biāo)本DNA提取方法將干標(biāo)本在STE緩沖液（0.10 mmol/L NaCl、10.00 mol/L Tris-Cl、1.00 mmol/L EDTA，pH=8.0）[10]中浸泡過夜，去離子水沖洗，晾干。稱取0.06 g標(biāo)本（豆象干標(biāo)本3～4頭）于2 mL玻璃研磨器中，再加入300 μL CTAB提取液（20 g/L CTAB、0.10 mol/L Tris-Cl、0.02 mol/L EDTA、1.45 mol/L NaCl，pH=8.0）研磨至細(xì)膩粉末狀。將研磨液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，用CTAB提取液補充至600 mL，再加12 μL β-巰基乙醇，充分混勻。離心管置于65 ℃恒溫水浴鍋中溫浴1 h，10 min左右晃動1次，取出，加5 μL蛋白酶K，37 ℃水浴2 h，加氯仿600 μL，混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清液，再加入450 μL CTAB混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清液。2次上清液合為1管，加等體積氯仿，12 000 r/min離心5 min，取上清液，加0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻，12 000 r/min離心10 min，用80%乙醇洗滌，晾干。加200 μL TE（10.00 mmol/L Tris-Cl、1.00 mmol/L EDTA，pH=8.0）緩沖液溶解，采用Eppendorf公司的核酸定量檢測儀（Biophotometer 6131）測定OD260/OD280值和 DNA 濃度，置于-20 ℃存放。

1.3CTAB提取方法 參照姚大彬等[11]的方法提取7種豆象基因組DNA，采用Eppendorf公司的核酸定量檢測儀（Biophotometer 6131）測定 OD260/OD280值和 DNA 濃度，置于-20 ℃存放。

1.4SDS提取方法 參照葛風(fēng)偉等[12]的方法提取7種豆象基因組DNA，采用Eppendorf公司的核酸定量檢測儀（Biophotometer 6131）測定 OD260/OD280值和 DNA 濃度，置于-20 ℃存放。

1.5DNA完整性驗證將以豆象干標(biāo)本DNA提取方法提取的7種豆象DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相，觀察DNA提取情況，驗證提取模板的完整性。

1.6PCR驗證 以豆象干標(biāo)本提取方法提取的7種豆象DNA模板，利用鞘翅目昆蟲DNA條形碼通用引物COⅠ序列進(jìn)行擴(kuò)增，確認(rèn)提取的DNA是否能擴(kuò)增出目的條帶。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物1：5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′；引物2：5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照劉翠霞等[13]的方法。PCR 產(chǎn)物上樣至 1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相，觀察是否有目的條帶產(chǎn)生。

2結(jié)果與分析

2.1DNA純度和濃度比較對于昆蟲類標(biāo)本的基因組DNA提取，一般認(rèn)為OD260/OD280值在1.70～1.90，DNA樣品較純。低于1.70說明樣品中含有少量蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì)，高于1.90說明RNA對DNA的污染較大。使用核酸定量檢測儀測定OD260/OD280值，對DNA純度進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。通過比較發(fā)現(xiàn)，采用豆象干標(biāo)本提取方法提取的7種豆象標(biāo)本DNA的OD260/OD280值基本上集中在1.70～1.90，符合基因組DNA提取的要求。采用CTAB方法提取的DNA OD260/OD280值大于1.90（花生豆象除外），表明CTAB法提取的干標(biāo)本DNA存在少部分RNA污染。采用SDS法提取的DNA OD260/OD280值均小于1.70，表明SDS法提取的干標(biāo)本DNA存在蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì)。

使用核酸定量檢測儀對DNA濃度進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)3種方法提取的基因組DNA濃度均能達(dá)到PCR反應(yīng)的可用值。相比較而言，僅就DNA濃度值來說，CTAB法提取DNA濃度最大，SDS法提取DNA濃度最小。

綜合DNA的純度和濃度可知，豆象干標(biāo)本提取方法比較適合后續(xù)PCR試驗的開展。

2.2DNA的完整性制備過程中，在用異丙醇沉淀時，已經(jīng)能用肉眼觀察到絮狀沉淀。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），以豆象干標(biāo)本DNA提取方法提取的7種豆象基因組DNA均可見清晰條帶，DNA條帶基本呈線形，很少有拖尾及彌散現(xiàn)象，說明提取的DNA雜質(zhì)較少，較為完整。

2.3PCR驗證結(jié)果用設(shè)計好的COⅠ通用引物對前面所提取的7種豆象基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖2。PCR結(jié)果顯示，所有豆象的基因組DNA均有特異性條形碼目的條帶出現(xiàn)擴(kuò)增，大小與文獻(xiàn)報道一致，說明所提取的DNA適合于后續(xù)分子試驗的開展。

3討論與結(jié)論

在該試驗中，通過查閱資料和參照其他DNA提取方法，改進(jìn)了豆象干標(biāo)本的DNA提取方法，通過試驗總結(jié)出從豆象干標(biāo)本中提取基因組DNA的關(guān)鍵處理措施。在長時間保存在標(biāo)本館或博物館里的干標(biāo)本中，基因組DNA降解很嚴(yán)重并且存在影響PCR擴(kuò)增的因素。將干標(biāo)本置于STE緩沖液里浸漬過夜，然后用去離子水沖洗，雖然比一般DNA提取方法時間上略顯長，但是對于豆象干標(biāo)本來說，此舉在于減少提取中基因組DNA的機(jī)械斷裂和其他阻斷，有利于保護(hù)干標(biāo)本基因組DNA的完整性，減輕或排除其對PCR擴(kuò)增的影響，因而十分有必要。

在此試驗中，采用玻璃研磨器取代傳統(tǒng)的液氮冷凍研磨。傳統(tǒng)的液氮研磨具有快速、省時、粉碎程度好的優(yōu)點，但是在操作中會使樣本產(chǎn)生水氣，影響樣品質(zhì)量。且由于液氮研磨過程中樣本損耗較大，對于豆象標(biāo)本一般需要10頭以上才能進(jìn)行研磨，實際工作中可操作樣本量一般很少，不足以用液氮研磨。使用玻璃研磨器可以對單頭蟲體甚至蟲體殘骸進(jìn)行樣品研磨，在檢驗檢疫工作中有著重要的意義。

研磨之后，在CTAB抽提液中加入β-巰基乙醇，起到了還原、保護(hù)DNA的目的，并且加快了蛋白質(zhì)失活，提高了最終提取物的純度和濃度。在65 ℃水浴之后，加入蛋白酶K并溫浴2 h，消解了提取核酸中的雜質(zhì)，提高了最終提取物的純度。

在該方法提取中，本身就有一個核酸反復(fù)提取的過程。通過核酸的反復(fù)提取，提高了最終提取物的濃度。通過測定OD260/OD280值，DNA完整性試驗，PCR驗證試驗充分證明了此豆象干標(biāo)本DNA提取方法的有效性。該方法能夠充分利用標(biāo)本室和歷年來積累的昆蟲標(biāo)本進(jìn)行科學(xué)研究，縮短了研究時間，節(jié)省了人力物力。

45卷14期李金慶等豆象干標(biāo)本基因組DNA提取方法的改進(jìn)參考文獻(xiàn)

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