小球藻熱水提取物功能成分的活性跟蹤分離

賈敬，徐殿勝，莊秀園，張道敬，陶黎明，李元廣

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小球藻熱水提取物功能成分的活性跟蹤分離

賈敬1，徐殿勝1，莊秀園1，張道敬1，陶黎明2，李元廣1

1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2 華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237

賈敬, 徐殿勝, 莊秀園, 等. 小球藻熱水提取物功能成分的活性跟蹤分離. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 743–756.Jia J, Xu DS, Zhuang XY, et al. Bioassay-guided isolation of functional components from hot water extract of Chlorella pyrenoidosa. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 743–756.

本研究旨在以自由基清除作用和促巨噬細(xì)胞增殖作用為導(dǎo)向，對(duì)小球藻熱水提取物 (CPE) 的分離純化產(chǎn)物進(jìn)行活性跟蹤，以確定CPE的主要功能成分。采用高壓熱水提取、Sevag除蛋白、乙醇沉淀和超濾的方法得到CPE粗多糖，然后通過(guò)DEAE52離子交換層析柱和Sephadex G-100對(duì)CPE粗多糖組分進(jìn)一步分離純化。研究結(jié)果表明，通過(guò)上述方法對(duì)CPE進(jìn)行分離純化，得到3種高活性成分PS-1-4-2、PS-1-3-2和PS-2-3-3，經(jīng)凝膠滲透色譜GPC分析得知其分子質(zhì)量分別為3.97×104Da、2.28×104Da和4.1×103Da?；钚愿櫧Y(jié)果表明，CPE能夠清除自由基并促進(jìn)巨噬細(xì)胞Ana-1細(xì)胞生長(zhǎng)，主要是由于其多種活性組分共同發(fā)揮作用，清除自由基作用的功能成分主要集中于PS-1-3、PS-1-4、PS-2-3和PS-2-4，促Ana-1細(xì)胞增殖作用的功能成分主要集中于PS-1-3、PS-1-4和PS-2-3。本研究確立了CPE主要功能成分的活性篩選手段，并獲得3種新型功能成分，可用于指導(dǎo)小球藻高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，從而進(jìn)一步推動(dòng)微藻能源的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)“高附加值微藻產(chǎn)品、微藻能源與微藻固碳”一體化的示范作用。

小球藻熱水提取物,活性跟蹤分離,自由基清除作用,促巨噬細(xì)胞增殖作用

蛋白核小球藻是一種食用歷史悠久、營(yíng)養(yǎng)豐富的健康食品[1]，具有多種功效，近年來(lái)已成為暢銷(xiāo)全球的功能性食品，2012年已被我國(guó)衛(wèi)生部公布為新資源食品[2]。小球藻功能成分中最引人注目的是一種被稱(chēng)為“小球藻生長(zhǎng)因子”的熱水提取物(Hot water extract of，簡(jiǎn)稱(chēng)CPE)。據(jù)報(bào)道，CPE在調(diào)節(jié)免疫活性[3-4]、改善代謝綜合征[5-6]、清除自由基[7-8]、清除體內(nèi)重金屬[9-10]等方面具有良好功效。由于CPE為非脂溶性物質(zhì)，從小球藻中提取油脂后并不影響CPE的活性，因此，從提取油脂后的藻渣中獲得CPE等高附加值產(chǎn)品，則可降低微藻開(kāi)發(fā)生物能源的生產(chǎn)成本，推動(dòng)微藻能源產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程[11]。

活性氧(ROS) 包括羥自由基、超氧陰離子、雙氧水和NO等[12]，是有機(jī)體進(jìn)行代謝產(chǎn)生的。ROS能減弱生物體的正常代謝系統(tǒng)，造成各種畸形，如心肌缺氧、致癌、炎癥和阿爾茲海默癥等[13]。羥自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，其反應(yīng)速度快，是對(duì)機(jī)體危害最大的自由基[14]。ROS的平衡是保持機(jī)體氧化還原平衡的重要條件[15]。近年來(lái)關(guān)于抗氧化活性物質(zhì)的研究報(bào)道很多，Seok等[16]從橢圓小球藻中分離得到一種抗氧化多肽。Rafiquzzaman等[17]從裙帶菜中分離得到的一種分子質(zhì)量為10 000 Da的糖蛋白，具有清除自由基、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)DNA免受損傷的作用。然而，遺憾的是這些物質(zhì)的抗氧化活性均不高，且質(zhì)量濃度需在1?10 mg/mL時(shí)才能發(fā)揮作用。

Erick等[18]從中分離得到一種磷酸化多聚糖，能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞NO的分泌。Hsu等[19]對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫刺激活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，小球藻多糖通過(guò)toll樣受體4 (TLR4) 介導(dǎo)的蛋白激酶信號(hào)通路活化巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞作為抵抗病原微生物的第一道防線，具有清除機(jī)體損傷組織細(xì)胞、吞噬外源病菌并激活其他免疫細(xì)胞的作用，同時(shí)還可作為抗原提呈細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用啟動(dòng)免疫反應(yīng)[20]。因此常被作為研究免疫調(diào)節(jié)活性的靶標(biāo)。

莊秀園等[11]指出不同原料來(lái)源、提取方法及活性跟蹤篩選技術(shù)得到的CPE產(chǎn)物的活性存在差異。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，CPE的研究主要集中于抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)活性，而作為一種水溶性混合物，CPE中起關(guān)鍵作用的主要活性成分至今沒(méi)有確切定論。前期研究中發(fā)現(xiàn)，利用高壓熱水萃取法制備的CPE在得率和生物活性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[21]，初步活性跟蹤表明，經(jīng)Sevag除蛋白、乙醇沉淀制備的多糖，在清除自由基及免疫調(diào)節(jié)活性方面更顯著。本文以高產(chǎn)油脂的“異養(yǎng)-稀釋-光誘導(dǎo)”串聯(lián)培養(yǎng)新模式生產(chǎn)的藻粉為原料，以自由基清除作用和促巨噬細(xì)胞(Ana-1) 增殖作用為活性跟蹤指標(biāo)，對(duì)上述粗多糖進(jìn)一步分離純化，以期獲得CPE中的主要功能成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白核小球藻藻粉由嘉興澤元生物制品有限責(zé)任公司提供；透析袋購(gòu)于北京鼎國(guó)科技有限公司，截留分子量為3 500 Da；二乙基氨基乙基52 (DEAE52) 購(gòu)于Whatman公司；葡聚糖凝膠(Sephadex G-100) 購(gòu)于GE公司；羥自由基試劑盒和超氧陰離子自由基試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司；Ana-1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS) 為Biosun產(chǎn)品；其他試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 CPE粗多糖的制備

510 g藻粉均勻懸浮于5 100 mL蒸餾水中，置于高壓滅菌鍋中，于121 ℃ (壓力為0.1 MPa) 萃取40 min。待冷卻后10 000 r/min 離心30 min，取上清。離心后的藻泥于等量蒸餾水中重懸，以相同條件進(jìn)行提取處理，取上清。兩次上清經(jīng)減壓抽濾濃縮后合并，冷凍干燥備用，得CPE粗組分。

CPE粗組分溶解于水后經(jīng)Sevag法除蛋白，80%乙醇沉淀得到粗多糖組分PS。將PS組分溶于適量蒸餾水中，于10 000 Da超濾離心管中超濾離心，6 000 r/min離心40 min，分別收集兩部分液體，80%乙醇溶液沉淀，60 ℃烘干。經(jīng)超濾離心分離得到的高分子量(大于10 000 Da) 的組分記為PS-1，低分子量(小于10 000 Da) 的組分記為PS-2。

1.3 CPE粗多糖的分離純化

CPE粗多糖組分PS-1/PS-2高活性組分經(jīng)DEAE52柱層析(5 cm×25 cm)，以濃度為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，透析濃縮，凍干備用。

PS-1/PS-2經(jīng)離子交換柱層析后產(chǎn)物中活性較高的組分上樣至Sephadex G-100柱(1.9 cm× 10 cm)，以3倍體積的蒸餾水洗脫，洗脫液以 5 mL/管收集，根據(jù)苯酚硫酸法測(cè)總糖含量、280 nm檢測(cè)蛋白質(zhì)的吸收峰、合并糖吸收峰和蛋白質(zhì)吸收峰，經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CPE多糖純化組分分析

采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品的總糖含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

純化后的樣品PS-1-4-2和PS-1-3-2采用高效液相色譜分析純度和分子量，色譜條件為：美國(guó)Agilent1200series高效液相色譜儀(Agilent Chemstation控制系統(tǒng)及凝膠滲透色譜GPC數(shù)據(jù)處理軟件)，色譜柱Ultrahydrogel 2 000和500兩根多糖專(zhuān)用凝膠色譜柱串聯(lián)(柱長(zhǎng) 300 mm，內(nèi)徑7.8 mm，排阻限分別為7×106和4×105Da)，以0.1 mol/L NaNO3溶液為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，柱溫度25 ℃，示差折光檢測(cè)器，分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為pullulan多糖。

純化后的樣品PS-2-3-3采用高效液相 色譜分析純度和分子量，色譜條件為：美國(guó) Agilent1200series高效液相色譜儀(Agilent Chemstation控制系統(tǒng)及凝膠滲透色譜GPC數(shù)據(jù)處理軟件)，色譜柱Shodex KS 802和804兩根多糖專(zhuān)用凝膠色譜柱串聯(lián)(柱長(zhǎng)300 mm，內(nèi)徑8 mm，排阻極限分別為4×105和1×104Da)，以0.2 mol/L NaCl溶液為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，柱溫度25 ℃，示差折光檢測(cè)器，分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為pullulan多糖。

1.5 CPE多糖組分抗氧化活性跟蹤

CPE多糖組分的清除自由基活性檢測(cè)按照南京建成有限公司的羥自由基(·OH) 試劑盒指示進(jìn)行操作。樣品的自由基清除能力根據(jù)下述公式進(jìn)行計(jì)算，以樣品對(duì)·OH的百分清除率表示。

1.6 CPE多糖組分促Ana-1增殖活性跟蹤

CPE多糖組分促Ana-1增殖活性以Ana-1細(xì)胞存活率表示。采用MTT法檢測(cè)CPE組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPE粗多糖得率及組分分析

CPE粗分產(chǎn)物的得率及組分分析如表1所示，PS-1和PS-2的得率分別為27.50 mg/g藻粉和20.90 mg/g藻粉。

表1可知CPE中蛋白質(zhì)組分的含量高于總糖含量，經(jīng)Sevag試劑去除游離蛋白后的PS糖含量明顯升高。經(jīng)超濾離心后得到的組分中PS-1的糖含量明顯升高，并且含有豐富的蛋白質(zhì)。PS-2組分以蛋白質(zhì)為主，并且含有較為豐富的糖。

表1 CPE粗分產(chǎn)物的得率及組分分析

2.2 CPE多糖分離純化產(chǎn)物得率及組分分析

表2為PS-1離子交換產(chǎn)物得率及組分分析，PS-1經(jīng)DEAE52離子交換層析分離得到的組分中得率最高為PS-1-1，PS-1-6的得率最低，僅為0.25 mg/g藻粉。總糖和蛋白質(zhì)含量分析可知PS-1經(jīng)離子交換層析分離后產(chǎn)物中含有較為豐富的總糖和蛋白質(zhì)。

PS-2離子交換產(chǎn)物得率及組分分析如表3所示，PS-2經(jīng)DEAE52離子交換層析分離得到的組分得率都很低，最高得率為PS-2-2，為3.56 mg/g藻粉。由總糖和蛋白質(zhì)含量分析可知，PS-2經(jīng)離子交換層析分離后產(chǎn)物中同樣含有較為豐富的總糖和蛋白質(zhì)，其中PS-2-1的蛋白質(zhì)較為豐富，總糖相對(duì)其他組分為最高；PS-2-3的蛋白質(zhì)含量最低，總糖含量較高；而PS-2-4的蛋白質(zhì)含量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于糖含量。

2.3 CPE多糖抗氧化活性跟蹤

2.3.1 CPE粗多糖·OH清除能力測(cè)試

CPE和PS均具有自由基清除活性(圖1)。在質(zhì)量濃度1 000 μg/mL時(shí)，PS對(duì)·OH的清除率為87.5% (0.01，與空白對(duì)照相比)，是Vc的89.3%。CPE和PS的清除活性均具有濃度依賴(lài)關(guān)系。與CPE相比，PS對(duì)·OH的清除活性明顯升高，與前期研究中多糖的抗氧化活性?xún)?yōu)于蛋白質(zhì)的活性一致[21]。

CPE多糖超濾分離組分·OH清除能力如圖2所示，PS-1和PS-2均具有較強(qiáng)的·OH清除能力，與空白對(duì)照相比，清除能力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.01)。濃度為1 000 μg/mL時(shí)PS-1的清除率高達(dá)78.81%，PS-2的清除率高達(dá)79.94%。通過(guò)組間比較發(fā)現(xiàn)，PS-1和PS-2清除能力未達(dá)到顯著性差異(0.05)，表明PS-1和PS-2的清除能力無(wú)明顯差異，因此PS-1和PS-2均存在具有抗氧化能力的功能成分，需對(duì)兩種組分分別進(jìn)行活性跟蹤。

表2 PS-1離子交換產(chǎn)物得率及組分分析

表3 PS-2離子交換產(chǎn)物得率及組分分析

圖1 CPE粗多糖·OH清除能力(n=6)

圖2 CPE多糖超濾分離組分·OH清除能力(n=6)

2.3.2 PS-1離子交換產(chǎn)物·OH清除能力測(cè)試

PS-1離子交換產(chǎn)物·OH清除能力如圖3所示。圖3表明PS-1-2、PS-1-3、PS-1-4均具有一定程度的·OH清除能力，且具有濃度依賴(lài)關(guān)系。其中PS-1-4的清除率在1 000 μg/mL時(shí)高達(dá)81.73%，為Vc的82.50%。PS-1-3和PS-1-4的清除能力均明顯高于PS-1-1、PS-1-2、PS-1-5和PS-1-6的活性，且PS-1-3和PS-1-4的組間數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PS-1主要為分子質(zhì)量大于10 000 Da的CPE多糖成分，上述結(jié)果表明，CPE中大分子質(zhì)量多糖的活性成分主要存在于PS-1-3或PS-1-4中，或者兩者均有。

2.3.3 PS-2離子交換產(chǎn)物·OH自由基清除能力測(cè)試

PS-2離子交換產(chǎn)物·OH清除能力如圖4所示。PS-2-1、PS-2-2、PS-2-3和PS-2-4都具有一定程度的自由基清除能力，且具有濃度依賴(lài)關(guān)系。PS-2-3和PS-2-4在1 000 μg/mL的清除率明顯高于其他組分。PS-2為分子質(zhì)量小于10 000 Da的CPE多糖成分，研究表明分子質(zhì)量較小的組分中的活性成分主要存在于PS-2-3或PS-2-4，或兩者都有，但其他組分中也含有部分活性較弱的成分。

2.3.4 PS-1-4純化組分·OH自由基清除能力測(cè)試

PS-1和PS-2經(jīng)過(guò)DEAE52分離得到的組分中，活性相對(duì)較高的為PS-1-3、PS-1-4、PS-2-3和PS-2-4。選取活性最高、分子質(zhì)量較大的組分PS-1-4和分子量較低的組分PS-2-3，對(duì)其進(jìn)行Sephadex G-100純化，根據(jù)洗脫曲線收集組分，以自由基清除率為跟蹤指標(biāo)，對(duì)其組分進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。

PS-1-4純化組分·OH自由基清除能力結(jié)果如圖5所示，PS-1-4純化得到的2種組分都有一定程度的·OH清除能力。經(jīng)活性比較，PS-1-4-2組分的清除能力優(yōu)于PS-1-4-3，與空白對(duì)照相比，PS-1-4-2的清除率達(dá)到極其顯著水平；與PS-1-4相比，PS-1-4-2和PS-1-4-3在1 000 μg/mL時(shí)具有顯著的清除能力。

圖3 PS-1離子交換產(chǎn)物·OH清除能力(n=6)

圖4 PS-2離子交換產(chǎn)物·OH清除能力(n=6)

圖5 PS-1-4 Sephadex G-100產(chǎn)物·OH清除能力(n=6)

2.3.5 PS-2-3純化組分·OH清除能力測(cè)試

PS-2-3純化組分·OH清除能力結(jié)果如圖6所示。PS-2-3經(jīng)Sephacryl S-100純化得到5種組分，均能夠有效清除反應(yīng)體系內(nèi)的·OH。通過(guò)活性比較，5種組分中清除自由基活性最高的組分為PS-2-3-2，1 000 μg/mL的清除率高達(dá)84.83%，且具有濃度依賴(lài)關(guān)系。PS-2-3-2的得率很低，不足以用于進(jìn)一步純化或結(jié)構(gòu)鑒定。PS-2-3-3具有很高的清除·OH活性，清除能力僅次于PS-2-3-2，1 000 μg/mL的清除率高達(dá)78.86%，且具有濃度依賴(lài)關(guān)系。

2.4 CPE多糖促細(xì)胞增殖能力測(cè)試

2.4.1 CPE粗多糖促細(xì)胞增殖能力測(cè)試

與CPE相比，PS的促細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng) (圖7)。在濃度為200 μg/mL時(shí)，PS作用下細(xì)胞的存活率高達(dá)168%，高于同濃度CPE作用下的細(xì)胞存活率(129%)。

PS-1和PS-2都能夠促進(jìn)Ana-1細(xì)胞生長(zhǎng)，其促增殖作用均具有濃度依賴(lài)關(guān)系(圖8)。其中PS-1的促增殖活性明顯高于PS-2，在質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)促增殖活性達(dá)到299%。由于Ana-1細(xì)胞是常見(jiàn)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，CPE及其分離組分能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，可能與Ana-1細(xì)胞的激活有關(guān)，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。

2.4.2 PS-1離子交換產(chǎn)物促細(xì)胞增殖能力測(cè)試

由于PS-1具有極強(qiáng)的促Ana-1細(xì)胞增殖能力，因此通過(guò)DEAE52分離得到PS-1的主要組分，對(duì)其進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖9所示。PS-1-2、PS-1-3、PS-1-4組分都能夠有效促進(jìn)Ana-1細(xì)胞生長(zhǎng)。其中PS-1-4具有明顯的濃度依賴(lài)關(guān)系，在質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)，促增殖能力達(dá)到60%。

圖6 PS-2-3 Sephacryl S-100產(chǎn)物·OH自由基清除能力(n=6)

圖7 CPE粗多糖對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響(n=6)

圖8 CPE多糖超濾組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響(n=6)

圖9 PS-1離子交換層析產(chǎn)物對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響(n=6)

2.4.3 PS-2離子交換組分促細(xì)胞增殖能力測(cè)試

PS-2-3能夠有效地促進(jìn)Ana-1細(xì)胞生長(zhǎng)，且具有濃度依賴(lài)關(guān)系，在質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)，促增殖能力達(dá)到51% (圖10)。PS-2-1、PS-2-2、PS-2-4、PS-2-5和PS-2-6均能夠不同程度地促進(jìn)Ana-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，但促增殖率低于20%。

2.4.4 PS-1-4純化組分促細(xì)胞增殖能力測(cè)試

PS-1-4經(jīng)Sephadex G-100純化組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響如圖11所示。PS-1-4純化組分中2種組分均能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，其中PS-1-4-2的促增殖作用相對(duì)較高，200 μg/mL時(shí)促增殖率達(dá)到87%。PS-1-4-2和PS-1-4-3對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響與劑量存在一定的效應(yīng)關(guān)系。

2.4.5 PS-1-3純化組分促細(xì)胞增殖能力測(cè)試

PS-1-3經(jīng)Sephadex G-100純化組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響如圖12所示。PS-1-3-2在200 μg/mL時(shí)促細(xì)胞增殖能力最高，促增殖率達(dá)到49%；PS-1-3-3在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，促增殖率為24%。

2.4.6 PS-2-3純化組分促細(xì)胞增殖能力測(cè)試

PS-2-3經(jīng)Sephacryl S-100純化組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響如圖13所示。圖13表明PS-2-3-3能夠顯著地促進(jìn)Ana-1細(xì)胞生長(zhǎng)，且具有濃度依賴(lài)關(guān)系，在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，促增殖能力達(dá)到42%。與PS-2-3-3相比，PS-2-3-2具有同樣的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，并且在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，促增殖率與濃度呈正相關(guān)。在濃度為200 μg/mL時(shí)，PS-2-3-2的促細(xì)胞增殖率為34%，略低于PS-2-3-3的活性。

圖10 PS-2離子交換層析組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響(n=6)

圖11 PS-1-4 Sephadex G-100組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響(n=6)

圖12 PS-1-3 Sephadex G-100組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響(n=6)

圖13 PS-2-3 Sephacryl S-100組分對(duì)Ana-1細(xì)胞存活率的影響(n=6)

2.5 純化組分的分子量測(cè)定

純化組分PS-1-4-2和PS-1-3-2采用GPC檢測(cè)，結(jié)果如圖14所示。圖14A中顯示PS-1-4-2組分經(jīng)GPC色譜分析，示差折光檢測(cè)器和UV檢測(cè)器信號(hào)(圖14B) 表明，PS-1-4-2組分是一種復(fù)合多糖，可能為糖蛋白、糖肽或蛋白聚糖。由已知分子量的普魯蘭多糖制定校正曲線，根據(jù)多糖純化產(chǎn)物的保留時(shí)間，由GPC軟件分析得到PS-1-4-2的重均分子量Mw=3.97×104Da，數(shù)均分子量Mn=1.12×103Da。示差折光檢測(cè)器信號(hào)顯示，樣品出峰時(shí)間為39.150 min。

圖14 PS-1-4-2和PS-1-3-2的凝膠滲透色譜圖

與PS-1-4-2相似，PS-1-3-2經(jīng)GPC軟件分析(圖14C和圖14D)，其重均分子量Mw= 2.28×104Da，數(shù)均分子量Mn=5.92×103Da，出峰時(shí)間為40.612 min。且PS-1-3-2在250 nm處有較強(qiáng)的洗脫峰信號(hào)，說(shuō)明其為糖蛋白或糖肽。

與PS-1分級(jí)分離純化的產(chǎn)物不同的是，PS-2分級(jí)純化產(chǎn)物分子量較小，均低于10 000 Da，因此PS-2通過(guò)一系列分離純化得到的產(chǎn)物PS-2-3-3通過(guò)Shodex KS 802和804分析結(jié)果如圖15所示。圖15A為PS-2-3-3產(chǎn)物經(jīng)淋洗后的示差折光檢測(cè)的信號(hào)，結(jié)果表明，該產(chǎn)物在20.354 min出峰，純度為97.16%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)多糖校正曲線，得知PS-2-3-3組分的Mw=4.10×103Da，Mn=3.93×103Da。圖15B表明PS-2-3-3組分在紫外檢測(cè)區(qū)域254 nm處有窄且單一的洗脫峰，說(shuō)明其含有蛋白或多肽側(cè)鏈，可能為糖蛋白或糖肽等物質(zhì)。

圖15 PS-2-3-3的凝膠滲透色譜圖

3 結(jié)論

筆者所在實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)一直致力于微藻活性成分的研究，前期研究中建立了以“異養(yǎng)-稀釋-光誘導(dǎo)”串聯(lián)培養(yǎng)的新型微藻培養(yǎng)模式[22]，實(shí)現(xiàn)了小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)，藻粉來(lái)源穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)成分豐富。

本研究分別以自由基清除作用和促巨噬細(xì)胞增殖作用作為活性指標(biāo)，對(duì)CPE粗多糖進(jìn)行分離純化。以自由基清除作用作為活性跟蹤指標(biāo)的研究表明，CPE多糖粗組分具有較高的抗氧化能力，CPE多糖中的多種組分均能夠清除自由基，活性成分主要集中于PS-1-3、PS-1-4、PS-2-3和PS-2-4組分中。在質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，PS-1-3、PS-1-4、PS-2-3和PS-2-4組分的清除率分別為76.61%、81.73%、80.03%和75.20%，其抗氧化活性高于文獻(xiàn)所報(bào)道的相同質(zhì)量濃度的其他物質(zhì)的多糖組分[14-23]。

以促巨噬細(xì)胞增殖作用活性跟蹤指標(biāo)的研究表明，CPE多糖能夠顯著地促進(jìn)巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中分子量較高的組分的促增殖作用高于低分子量組分，主要功能成分集中在PS-1-3、PS-1-4和PS-2-3中。質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)，PS-1-3、PS-1-4的促增殖率分別為37%、60%；質(zhì)量濃度為250 μg/mL時(shí)，PS-2-3的促增殖率為51%。CPE功能成分的促巨噬細(xì)胞增殖活性高于文獻(xiàn)報(bào)道的相同濃度下的小球藻多糖[24]和海帶多糖[25]，并且其最高促增殖活性與經(jīng)化學(xué)修飾后的銀合歡多糖提取物相當(dāng)[26]。

對(duì)純化組分PS-1-4-2、PS-1-3-2和PS-2-3-3進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，經(jīng)GPC分析，其重均分子質(zhì)量分別為3.97×104Da、2.28×104Da和4.10×103Da，由于其在254 nm處有較強(qiáng)的吸收峰，推測(cè)其可能為新結(jié)構(gòu)的糖蛋白。

本文以國(guó)內(nèi)外首創(chuàng)的“異養(yǎng)-稀釋-光誘導(dǎo)”培養(yǎng)模式生產(chǎn)的蛋白核小球藻藻粉為原料，對(duì)其熱水提取物進(jìn)行一系列的活性跟蹤，確立了以抗氧化活性和促巨噬細(xì)胞增殖活性為主的跟蹤手段，對(duì)其進(jìn)行高壓熱水提取、Sevag除蛋白、乙醇沉淀、超濾等初步分離，采用離子交換層析以及體積排阻層析等純化手段，最終得到3種CPE的主要功能成分。這一研究為小球藻作為高附加值產(chǎn)品的眾多功效提供了科學(xué)依據(jù)， 同時(shí)提高小球藻生物質(zhì)的利用率，平衡高附加值產(chǎn)品與高油脂含量的不協(xié)調(diào)關(guān)系，從而進(jìn)一步推動(dòng)微藻能源的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)“高附加值微藻產(chǎn)品、微藻能源與微藻固碳”一體化的示范作用。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Bioassay-guided isolation of functional components from hot water extract of

Jing Jia1, Diansheng Xu1, Xiuyuan Zhuang1, Daojing Zhang1, Liming Tao2, and Yuanguang Li1

1State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

The main functional ingredients of hot water extract of(CPE) were investigated through a bioassay-guided fractionation based on free radical scavenging and macrophage proliferation effects. The main functional ingredients of CPE were polysaccharides (PS) that were isolated by high pressure extraction, Sevag method, ethanol precipitation and ultrafiltration separation. Crude polysaccharides were further separated and purified by ion exchange chromatography DEAE52 and size exclusion chromatography Sephadex G-100. The purified fractions were analyzed by gel permeation chromatography. Molecular weights of the purified fractions PS-1-4-2, PS-1-3-2 and PS-2-3-3 were 3.97×104, 2.28×104and 4.1×103Da, respectively. Bioassay-guided fractionation results indicated that CPE could remove free radicals and promote Ana-1 cells proliferation, mainly due to its various components working together. The components of free radicals scavenging mainly concentrated in PS-1-3, PS-1-4, PS-2-3 and PS-2-4. The components of Ana-1 proliferation mainly concentrated in PS-1-3, PS-1-4 and PS-2-3. This study established the activity screening method of main functional component from CPE, and got three new functional ingredients. It can be used to guide the development of high value products, further promote the industrialization process of microalgae energy, and realize microalgae ‘high value products, microalgae energy and microalgae carbon’ integration of exemplary role.

hot water extract of, bioassay-guided isolation, free radical scavenging, macrophage proliferation

October 15, 2016; Accepted:January 16, 2017

Yuanguang Li. Tel/Fax: +86-21-64250964; E-mail: ygli@ecust.edu.cn Daojing Zhang. Tel/Fax: +86-21-64252104; E-mail: djz@ecust.edu.cn

10.13345/j.cjb.160382

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA022004).

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No. 2014AA022004) 資助。

2017-04-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170406.1102.001.html