ERK12信號通路在紫杉醇誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡中的作用分析

張潮團(tuán)　鄭權(quán)

【摘要】 目的：探討ERK12信號通路在紫杉醇誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡中的作用。方法：培養(yǎng)直腸癌細(xì)胞系CX1作為研究標(biāo)本，分別單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇、紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059作用于直腸癌細(xì)胞系CX1，應(yīng)用MTT法檢測兩者對直腸癌細(xì)胞的殺傷力。結(jié)果：（1）不同藥物濃度下，紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059作用72 h的直腸癌細(xì)胞生長抑制率均較單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇高（P<0.05）。（2）紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059作用24、48 h的細(xì)胞凋亡率均較單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇高（P<0.05）。結(jié)論：通過抑制ERK12信號通路，能夠增強(qiáng)紫杉誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用。

【關(guān)鍵詞】 直腸癌； ERK12信號通路； 紫杉醇； 細(xì)胞凋亡； 作用

Analysis the Role of ERK12 Signaling Pathway in Taxol Induced of Colorectal Cancer Cell Apoptosis/ZHANG Chao-tuan，ZHENG Quan.//Medical Innovation of China，2017，14（16）：032-034

【Abstract】 Objective：To study the ERK12 signaling pathways in taxol induce the role of apoptosis of colon cancer.Method：Cultivate CX1 colorectal cancer cell line as the research samples，used drug，Taxol +ERK12 separately signaling pathway inhibitor PD98059 CX1 role in colorectal cancer cell line，determined by MTT method was applied to detect both lethality of colorectal cancer cells.Result：（1）under different concentrations of drug，Taxol +ERK12 signaling pathway inhibitor PD98059 72 h of colorectal cancer cells growth inhibition rate were relatively high application paclitaxel alone（P<0.05）.（2）Taxol+ERK12 signaling pathway inhibitor PD98059 role within 24 and 48 h，apoptosis rate were relatively high application paclitaxel alone（P<0.05）.Conclusion：By inhibiting ERK12 signaling pathways，can enhance the effect of yew induced rectal cancer cell apoptosis.

【Key words】 Colorectal cancer； ERK12 signaling pathways； Taxol； Cell apoptosis； Role

First-authors address：The Peoples Liberation Army 421th General Surgery Center Hospital，Guangzhou 510000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.16.009

直腸癌的發(fā)病范圍為齒狀線至直腸乙狀結(jié)腸交界，由于病灶位置深入盆腔，解剖關(guān)系復(fù)雜，故手術(shù)治療難以徹底，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，遠(yuǎn)期預(yù)后較差[1-3]。針對直腸癌手術(shù)治療存在的弊端，近年來越來越多的直腸癌患者選擇接受手術(shù)治療聯(lián)合術(shù)后化療[4]。但伴隨著臨床對直腸癌化療作用機(jī)制的深入研究，不斷有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)ERK12信號傳導(dǎo)通路被激活后會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化和增殖，并推測ERK12信號傳導(dǎo)通路的異常激活可能參與了直腸癌患者腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移的過程[5-7]?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀，本研究對ERK12信號通路在紫杉醇誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行分析，旨在明確ERK12信號通路對直腸癌患者臨床療效的影響，為臨床制定直腸癌患者的治療方案提供參考價(jià)值，以進(jìn)一步改善直腸癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究標(biāo)本為直腸癌細(xì)胞系CX1。

1.2 方法

1.2.1 直腸癌細(xì)胞培養(yǎng) 直腸癌細(xì)胞系CX1的培養(yǎng)液為10%胎牛血清（經(jīng)30 min滅活）和慶大霉素12 U/mL，培養(yǎng)液溫度56 ℃，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度37 ℃、飽和濕度、5% CO2，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞開展研究。

1.2.2 兩種藥物方案的敏感性檢測 應(yīng)用MMT（噻唑藍(lán)）檢測紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059和紫杉醇對直腸癌細(xì)胞的敏感性。具體方法為：在96孔板上接種直腸癌細(xì)胞，濃度為1×105個(gè)/mL。先放在培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h，觀察細(xì)胞貼壁后，將96個(gè)孔板分為兩組，其中一組加入濃度為10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L的紫杉醇，另一組加入ERK12信號通路抑制劑PD98059后在加入不同濃度的紫杉醇。兩組均繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)至69 h時(shí)于每個(gè)孔板中加入20μL MMT，4 h后將上清液吸出，加入100 DMSO，充分混勻后，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測細(xì)胞的OD值，計(jì)算兩組的直腸癌細(xì)胞生長抑制率。計(jì)算公式為：抑制率=（1-存活率）×100%，存活率為兩組OD值的比值與10%的乘積。

1.2.3 直腸癌細(xì)胞周期解析 在6孔板上接種直腸癌細(xì)胞，濃度為1×106個(gè)/mL。在每個(gè)孔板中加入3.5 mL培養(yǎng)液，之后分別加入濃度為10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L的紫杉醇和ERK12信號通路抑制劑PD98059。于加入PD98059后24、48 h收集細(xì)胞，在收集的細(xì)胞中加入冷PBS，以1000 r/min的速度離心5 min，洗滌2次，加入體積比為70%的4 ℃乙醇過夜，在1000 r/min的速度離心5 min，洗滌2次，加入100 μL碘化丙啶，放在4 ℃閉光的環(huán)境中染色30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞及配套軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行解析。

1.3 觀察指標(biāo) 本研究選取的關(guān)注指標(biāo)包括：（1）不同藥物濃度下（10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L），紫杉醇、紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059作用72 h的直腸癌細(xì)胞抑制率；（2）紫杉醇、紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059作用24、48 h直腸癌細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0版本統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件建立數(shù)據(jù)分析模型，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例（%）描述，比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物濃度下兩種藥物方案作用72 h的直腸癌細(xì)胞生長抑制率比較 10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L濃度下，紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059作用72 h的直腸癌細(xì)胞生長抑制率均較單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇高（P<0.05），見表1。

2.2 兩種藥物方案作用24、48 h的直腸癌細(xì)胞凋亡率比較 在高倍鏡下觀察紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑PD98059作用24、48 h的直腸癌細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)選取視野內(nèi)100個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)兩種藥物方案的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示紫杉醇+ERK12信號通路抑制劑兩個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)的直腸癌細(xì)胞凋亡率均高于單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇（P<0.05），見表2。

3 討論

紫杉醇為我國臨床治療卵巢癌和乳腺癌的常用藥物，其本質(zhì)是紅豆杉屬植物中的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前我國醫(yī)療領(lǐng)域上使用的唯一可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物[8-10]。藥理研究證實(shí)該種藥物的微蛋白結(jié)合十分穩(wěn)定，能夠抑制微管正常的力學(xué)重組，并能影響細(xì)胞的正常分裂，從而能夠抑制細(xì)胞內(nèi)某些調(diào)控因素對微管的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。近年來的臨床研究均報(bào)道該種藥物在卵巢癌和乳腺癌患者臨床治療中的應(yīng)用，能夠獲良好的臨床療效，但關(guān)于該藥物在直腸癌患者臨床治療中的應(yīng)用，卻鮮有報(bào)道[12-13]。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，紫杉醇對荷瘤裸鼠具有明顯療效，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)ERK信號傳導(dǎo)系統(tǒng)會對紫杉醇治療荷瘤裸鼠的療效產(chǎn)生影響[14-15]。

ERK是介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，普遍存在于多種哺乳動物體內(nèi)，該信號通路能夠?qū)⒓?xì)胞信號逐級擴(kuò)大傳入細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞外的刺激物和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中的效應(yīng)分子連接，對于細(xì)胞的生長和分化具有促進(jìn)作用[16-18]?，F(xiàn)階段，我國臨床研究最多的ERK信號通路為ERK12，主要研究內(nèi)容為該信號通路對惡性腫瘤患者疾病治療效果的影響[19]。直腸癌手術(shù)治療術(shù)后復(fù)發(fā)率高，我國臨床尚缺乏能夠改善直腸癌患者術(shù)后遠(yuǎn)期預(yù)后的有效治療方案[20]。本研究旨在通過明確ERK12信號通路在紫杉醇誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡中的作用，對現(xiàn)有的直腸癌治療方案進(jìn)行改建。研究結(jié)果顯示紫杉醇+PD98059作用下的直腸癌細(xì)胞生長抑制率、凋亡率均明顯高于單用紫杉醇。分析ERK12信號通路影響紫杉醇治療直腸癌療效的作用機(jī)制為：直腸癌細(xì)胞受到外南街刺激后能夠機(jī)會ERK1，促使ERK12發(fā)生磷化，細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核對，激活細(xì)胞核內(nèi)的下游底物，介導(dǎo)一些原癌基因的活化，對細(xì)胞的生長產(chǎn)生調(diào)控作用，促使癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。

對上述研究結(jié)果進(jìn)行分析，本研究認(rèn)為ERK12信號通路會對紫杉醇治療直腸癌的療效產(chǎn)生影響，通過抑制ERK12信號通路，能夠增強(qiáng)紫杉誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用。但由于現(xiàn)階段我國臨床同類臨床研究報(bào)道較少，本院本次研究過程中的操作有待進(jìn)一步規(guī)范，因此本研究所得結(jié)果仍需更多研究學(xué)者進(jìn)行大量實(shí)踐研究驗(yàn)證。

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（收稿日期：2017-03-08） （本文編輯：周亞杰）