不同誘導(dǎo)子對澤瀉中23—乙酰澤瀉醇B積累的影響

李清　周以飛　劉崟艷等

摘要：采用不同濃度的水楊酸、赤霉素和脫落酸處理澤瀉植株，研究不同誘導(dǎo)子對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B積累的影響。結(jié)果表明，水楊酸、赤霉素和脫落酸在低濃度下都能促進(jìn)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的積累，在高濃度下則表現(xiàn)出一定的抑制作用。150 μg/mL的水楊酸處理第8天時(shí)，23-乙酰澤瀉醇B的含量為715.4 μg/g，為所有處理中的最大值。赤霉素和脫落酸的處理效果與水楊酸相比較差。

關(guān)鍵詞：澤瀉；23-乙酰澤瀉醇B；誘導(dǎo)子

中圖分類號：Q949.71+2.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1125-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.025

Abstract： In order to study the effect of different elicitors on the accumulation of alisol B 23-acetate in [Alisma orientale（Samuels）Juzep.]， A. rhizoma plants were treated by SA， GA and ABA with different concentration. The results showed that low concentration of SA， GA and ABA promoted the accumulation of alisol B 23-acetate， while the high concentration had inhibition. The content of alisol B 23-acetate was 715.4 μg/g， the highest content at the eighth day after treated by SA. Compared with SA， the effects of GA and ABA were poorer.

Key words： [Alisma orientale （Samuels） Juzep.]； alisol B 23-acetate； elicitor

澤瀉是一種常見的中藥材，是由澤瀉科（Alismataceae）多年生植物澤瀉[Alisma orientale（Samuels）Juzep.]的塊莖干燥炮制而成。澤瀉性味甘淡寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱和化濁降脂的功效，用于小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛和高血脂等[1]。澤瀉的主要化學(xué)成分為三萜類物質(zhì)，其中最主要的藥用成分為23-乙酰澤瀉醇B[2]。近年來，隨著人們對23-乙酰澤瀉醇B的深入研究，發(fā)現(xiàn)23-乙酰澤瀉醇B具有很多非常重要的生物活性[3]，如抗癌[4]、誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡[5]和抑制乙肝病毒抗原活性[6]等作用。

誘導(dǎo)子（Elicitors）是一種特殊的誘發(fā)因子，能夠開啟植物體內(nèi)代謝過程中酶的活性，因而能夠顯著地增加植物中次生代謝產(chǎn)物的含量，有時(shí)候甚至能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生出新的次生代謝產(chǎn)物。目前，誘導(dǎo)子已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多中藥材次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中，如人參[7]、魚腥草[8]、丹參[9]、藏紅花、黃芩等。但是誘導(dǎo)子在澤瀉中的研究卻鮮有報(bào)道。為此，試驗(yàn)采用水楊酸、赤霉素和脫落酸三種誘導(dǎo)子分別處理澤瀉，研究澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2013年7月至2014年1月在福建農(nóng)林大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行，供試材料澤瀉種子為福建中醫(yī)藥大學(xué)吳錦忠教授提供。澤瀉種子于2013年7月8日播種育苗，苗期40 d，2013年8月18日移栽至大田，大田前作為水稻。

試劑：乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為娃哈哈超純水，標(biāo)準(zhǔn)品23-乙酰澤瀉醇B購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心，水楊酸、赤霉素、脫落酸、無水乙醇、石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等均為國產(chǎn)分析純。

儀器：烘干箱（上海精宏）、FY135中草藥粉碎機(jī)、BS124S 型電子天平、3200 IH 型超聲波清洗器、UV 1700-1800紫外可見分光光度計(jì)（上海鳳凰光學(xué)科技有限公司）、美國Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2996檢測器。

1.2 方法

1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇植物形態(tài)、營養(yǎng)狀況相近的盆栽澤瀉植株45盆，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15盆。在相同的栽培條件，將15盆澤瀉分成3組放置于水田中，每組5盆縱向擺放，保持40 cm的間距，每組噴施一種不同種類的誘導(dǎo)子（水楊酸、赤霉素、脫落酸），每組中5盆植株噴施的誘導(dǎo)子的濃度分別為 0、50、100、150、200 μg/mL（誘導(dǎo)子都采用1%乙醇溶解）。噴施誘導(dǎo)子之前取樣一次作為對照，之后在處理的第4、8、12、16天分別取樣一次，采用高效液相色譜法檢測各個(gè)樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量。

2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。稱取標(biāo)準(zhǔn)品23-乙酰澤瀉醇B 4 mg，置于5 mL的離心管中，取4 mL色譜純乙腈短暫超聲混勻，制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。0.22 μm濾頭過濾備用。

3）材料準(zhǔn)備。澤瀉樣品在烘干箱中經(jīng)60 ℃干燥至恒重。干燥后的樣品用FY135中草藥粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用。精密稱取樣品粉末0.3 g，加入20 mL石油醚，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，濾紙過濾。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入1 mL色譜純乙腈溶解蒸干的樣品，溶液用0.22 μm濾頭過濾，備用[10，11]。

4）統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 23-乙酰澤瀉醇B的檢測

采用高效液相色譜法檢測，色譜柱：Waters C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈-水（80∶20，V/V）；流速：0.8 mL/min，檢測波長：208 nm；進(jìn)樣量：20 μL，進(jìn)樣時(shí)間：20 min[12，13]。結(jié)果見圖1和圖2。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取300 μg/mL的23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次， 每次進(jìn)樣體積20 μL。測得23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD為1.70%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批的澤瀉粉末6份，依照上述方法制備供試溶液，進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD為1.74%，說明該方法重復(fù)性較好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取澤瀉粉末0.3 g， 依照上述方法制備供試溶液，分別在1、2、4、8、12 h進(jìn)樣檢測，結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B峰面積的RSD為0.93%，說明從澤瀉中提取的23-乙酰澤瀉醇B在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取澤瀉塊莖粉末6份，每份0.3 g，其中3份加入0.2 mL的濃度為300 μg/mL的23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品溶液，3份不加，依照上述方法制備供試溶液，進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率為98.1%，RSD為3.10%。

2.3 23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制成25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。按色譜條件，每個(gè)濃度進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，取峰面積的平均值。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度X為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。23-乙酰澤瀉醇B的標(biāo)準(zhǔn)曲線為=25 327 X-48 665，R2= 0.999 6，線性范圍為25～500 μg/mL，結(jié)果見圖3。

2.4 不同誘導(dǎo)子對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B積累的影響

2.4.1 水楊酸處理對23-乙酰澤瀉醇B積累的影響 采用0、50、100、150、200 μg/mL五個(gè)不同濃度的水楊酸對盆栽澤瀉進(jìn)行處理，在處理的第0、4、8、12、16天分別取樣，利用HPLC法測定樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果如圖4。

由圖4可知，不同濃度的水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量有一定的影響。50 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值391.6 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的3.13倍。100 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值420.2 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的3.36倍。150 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值715.4 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的5.72倍。200 μg/mL的水楊酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先下降后上升的趨勢，并在第8天達(dá)到了最低值66.7 μg/g，為對照23-乙酰澤瀉醇B含量的53.3%。

采用DPS軟件對不同濃度水楊酸處理后樣品中23-乙酰澤瀉醇B含量進(jìn)行二因素方差分析，結(jié)果見表1、表2和表3。

由表1、表2和表3可知，150 μg/mL水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，與對照相比差異極顯著。100 μg/mL和50 μg/mL水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，但與對照相比差異不顯著。200 μg/mL水楊酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，但與對照差異不顯著。處理時(shí)間對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的影響作用不明顯，只有第8天表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，與對照和16 d處理相比差異極顯著，與其他處理相比差異顯著。

2.4.2 赤霉素處理對23-乙酰澤瀉醇B積累的影響

采用0、50、100、150、200 μg/mL五個(gè)不同濃度的赤霉素對盆栽澤瀉進(jìn)行處理，在處理的第0、4、8、12、16天分別取樣，利用HPLC法測定樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果如圖5。

由圖5可知，不同濃度的赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量有一定的影響。50 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第12天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值248.5 μg/mL，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的1.79倍。100 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值462.3 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的3.49倍。150 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值285.3 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的2.15倍。200 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先下降后上升的趨勢，并在第8天達(dá)到了最低值66.4 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的50.1%。

采用DPS軟件對不同濃度赤霉素處理后樣品中23-乙酰澤瀉醇B含量進(jìn)行二因素方差分析，結(jié)果見表4、表5和表6。

由表4、表5和表6可知，100 μg/mL赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，與對照相比差異極顯著。150 μg/mL和50 μg/mL赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，但與對照相比差異不顯著。200 μg/mL赤霉素處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，但與對照相比差異不顯著。處理時(shí)間對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的影響作用不明顯，只有第8天表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，與對照和第16天相比差異顯著，其他處理間均差異不顯著。

2.4.3 脫落酸處理對23-乙酰澤瀉醇B積累的影響 采用0、50、100、150、200 μg/mL五個(gè)不同濃度的脫落酸對盆栽澤瀉進(jìn)行處理，在處理的第0、4、8、12、16天分別取樣，利用HPLC法測定樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果如圖6。

由圖6可知，不同濃度的脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量都是有一定的影響。50 μg/mL的脫落酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第12天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值178.4 μg/mL，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的1.20倍。100 μg/mL的脫落酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值256.0 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的1.68倍。150 μg/mL的脫落酸處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢，并在第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量達(dá)到最大值393.6 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的2.59倍。200 μg/mL的赤霉素處理下，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先下降后上升的趨勢，并在第12天達(dá)到了最低值102.7 μg/g，是對照23-乙酰澤瀉醇B含量的69.1%。

采用DPS軟件對不同濃度脫落酸處理后樣品中23-乙酰澤瀉醇B含量進(jìn)行二因素方差分析，結(jié)果見表7、表8和表9。

由表7、表8和表9可知，150 μg/mL脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，與對照相比差異極顯著。100 μg/mL和50 μg/mL脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，但與對照相比差異不顯著。200 μg/mL脫落酸處理對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，但與對照相比差異不顯著。處理時(shí)間對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量的影響作用不明顯，只有處理第8天時(shí)與對照差異顯著。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同類型以及不同濃度的外源誘導(dǎo)子對澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的累積會(huì)產(chǎn)生一定影響，但其影響程度不同。從總體趨勢來看，在使用誘導(dǎo)子處理后的一段時(shí)間內(nèi)，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量呈先上升后下降的趨勢。從濃度上看，3種不同的誘導(dǎo)子在低濃度下都能促進(jìn)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的積累，在高濃度下則表現(xiàn)出一定的抑制作用。

水楊酸是各種植物體內(nèi)都普遍存在的一種小分子的酚類物質(zhì)，大量試驗(yàn)證明，外源水楊酸進(jìn)入植物體內(nèi)，能夠有效促進(jìn)植物生長發(fā)育，誘導(dǎo)植物種子的萌發(fā)，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)乙烯的合成，誘導(dǎo)植物自身抗病、抗蟲、抗干旱、抗鹽脅迫等防御反應(yīng)[14]。水楊酸通過對植物體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)，最終能提高植物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究中水楊酸處理后，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其中150 μg/mL的水楊酸處理第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量為715.4 μg/g，為所有處理中的最大值。這些結(jié)果可能與水楊酸能夠促進(jìn)植物的生長發(fā)育和誘導(dǎo)植物的抗逆性有關(guān)。

赤霉素是一大類廣泛存在的植物激素，具有很強(qiáng)的生物活性。在植物體內(nèi)能夠促進(jìn)莖葉的伸長生長，加速細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞縱向生長，抑制側(cè)芽的休眠等[15]。本研究中赤霉素處理后，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其中100 μg/mL的赤霉素處理第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量為462.3 μg/g，誘導(dǎo)效果與水楊酸相比較差。

脫落酸作為一種重要的植物激素在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用，能夠促進(jìn)植物葉片和果實(shí)的脫落、促使植物的芽休眠并且抑制其萌發(fā)、抑制植物生長、促進(jìn)植物衰老等。脫落酸還能夠誘導(dǎo)植物對各種不同的不良環(huán)境產(chǎn)生抗性，如抗旱性、抗病性、抗寒性和耐鹽性等[16，17]。試驗(yàn)中脫落酸處理后，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其中150 μg/mL的脫落酸處理第8天時(shí)23-乙酰澤瀉醇B的含量為393.6 μg/g，誘導(dǎo)效果與水楊酸相比較差。這種結(jié)果可能是由于脫落酸能夠抑制植物的生長造成的。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 朱玉嵐，彭國平.澤瀉的萜類化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（2）：348-351.

[3] 陳 濤，劉 本.澤瀉中成分澤瀉萜醇B乙酸酯研究進(jìn)展[J].科技通報(bào)，2008，24（4）：485-488.

[4] FONG W F， WANG C， ZHU G Y， et al. Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by alisol B 23-acetate[J]. Biochemical Pharmacology， 2004， 14： 160-165.

[5] HUANG Y T， HUANG D M， CHUEH S C， et al. Alisol B acetate， a triterpene from Alismatis rhizoma， induces Bax nuclear translocation and apoptosis in human hormone-resistant prostate cancer PC-3 cells[J]. Cancer Lett， 2006， 231： 270-278.

[6] JIANG Z Y， ZHANG X M， ZHANG F X， et al. A new triterpene and anti-hepatitis B virus active compounds from Alisma orientalis[J]. Planta Med，2006，72（10）：951-954.

[7] 周倩耘，周健民，劉 峻，等.誘導(dǎo)子對人參毛狀根中皂苷含量的影響[J].南京軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，25（2）：76-78.

[8] 倪細(xì)爐，譚玲玲，王玲麗，等.不同誘導(dǎo)子處理對魚腥草幼苗槲皮素含量的影響[J].魯東大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，24（3）：254-259.

[9] 焦蒙麗，曹蓉蓉，陳紅艷，等.水楊酸對丹參培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香生物合成及其相關(guān)酶的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（3）：320-328.

[10] 陳建忠，潘 馨，黃若旺.HPLC法同時(shí)測定澤瀉中2種有效成分的含量[J].藥物分析雜志，2007，27（5）：721-723.

[11] 吳秋云，陳艷紅，謝友良.不同產(chǎn)地澤瀉有效成分的含量測定[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2010，10（17）：60-61.

[12] 馬嫄慧，王欣月，王真珍，等.湖北澤瀉的HPLC分析及有效成分含量測定[J].氨基酸和生物資源，2008，30（3）：81-85.

[13] 王立新，吳啟南，彭國平.澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量測定研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，18（2）：105-107.

[14] 李德紅，潘瑞熾.水楊酸在植物體內(nèi)的作用[J].植物生理學(xué)通訊，1995，31（2）：144-149.

[15] 李保珠，趙 翔，安國勇.赤霉素的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（1）：1-5.

[16] GAO Y， ZENG Q， GUO J， et al. Genetic characterization reveals no role for the reported ABA receptor， GCR2， in ABA control of seed germination and early seedling development in Arabidopsis[J]. Plant J， 2007， 52（6）： 1001-1013.

[17] DAVIES WILLIAM J， WILKINSON S， LOVEYS B. Stomatal control by chemical signalling and the exploitation of this mechanism to increase water use efficiency in agriculture[J]. New Phytologist， 2002， 153（3）： 449-460.