云芝糖肽水提醇沉提取工藝

□ 梁曉婷 廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院

云芝糖肽水提醇沉提取工藝

□ 梁曉婷 廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院

避免了有毒溶劑使用，本文建立了水提醇沉法提取純化云芝糖肽的技術(shù)方法，以期為云芝糖肽無公害生產(chǎn)提供參考。

云芝糖肽；水提醇沉；提取工藝

云芝糖肽系從云芝或培養(yǎng)的菌絲中提取純化的結(jié)合蛋白多糖，是良好的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，對遷延性肝炎、慢性肝炎有良好的療效，能抑制癌細胞的增生，屬于國家II類新藥。目前，云芝糖肽大多是采用水提醇沉的方式提取，但使用到氯仿和正丁醇等有毒有機溶劑。為了解決這個缺點和不足，本研究采用熱水浸提，無水乙醇沉淀，并優(yōu)化該提取工藝。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

潔凈工作臺、分析天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計和高速冷凍離心機。經(jīng)優(yōu)選LN-CV0707云芝菌株液體發(fā)酵菌絲體[1]。牛血清白蛋白、福林-酚試劑、無水乙醇均為分析純。

1.2 云芝糖肽水提醇沉提取

準(zhǔn)確稱取1 g（精度至0.1 mg）凍干的菌絲體粉末，加入蒸餾水50 mL，按一定溫度、時間、料水比，置恒溫水浴鍋中提取2次，然后9 000 r/ min離心20 min，上清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮定容至2 mL，加入6 mL無水乙醇，混勻后4 ℃過夜醇沉后9 000 r/min離心10 min，得到的沉淀真空干燥，即得云芝糖肽。云芝糖肽提取率（%）=云芝糖肽質(zhì)量/菌粉質(zhì)量×100%。

1.3 云芝糖肽中肽含量的測定

取0.25 mg/mL牛血清白蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL分別置于具塞試管中，加水定容至1.0 mL，加5.0 mL福林-酚試劑甲溶液。搖勻后放置5 min，加0.5 mL福林-試劑乙溶液，混勻后放置20 min，在500 nm波長處測定其吸收度，并建立回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同破碎方式對云芝糖肽提取率的影響

考察了高壓均質(zhì)和勻漿機勻漿兩種破碎方式對菌絲體內(nèi)云芝糖肽提取率的影響。試驗結(jié)果表明：高壓均質(zhì)法破碎提取的云芝糖肽提取率（62.3 mg/g）較高，比勻漿機勻漿提取率高（48.7 mg/g）。從提取率大小考慮，應(yīng)選擇高壓均質(zhì)法，但由于在小試階段的發(fā)酵液較少，勻漿機勻漿法成本低。因此，選擇勻漿機勻漿作為小試階段云芝糖肽水提醇沉提取方式。

2.2 提取溫度對云芝糖肽提取率的影響

考察了50、60、70、80、90 ℃和100 ℃等不同提取溫度對云芝糖肽提取率的影響（圖1）。從圖1中可知，隨著提取溫度的升高，云芝糖肽提取率逐漸升高；當(dāng)溫度為40℃時，云芝糖肽提取率僅約為80 ℃的一半；當(dāng)溫度升至80 ℃以上時，云芝糖肽提取率下降，而且趨于平緩。考慮溫度過高可引起變性等可能性，采用提取溫度80 ℃為宜。

圖1 提取溫度對云芝糖肽提取率的影響圖

2.3 提取時間對云芝糖肽提取率的影響

考察了不同提取時間對云芝糖肽提取效果的影響。試驗結(jié)果表明：提取時間對云芝糖肽提取效果具有顯著的影響，當(dāng)提取時間在1～2 h，云芝糖肽提取率隨著提取時間的增加而增大，當(dāng)提取時間為2 h時，提取率最大，約為48.3 mg/g；當(dāng)繼續(xù)增大時，云芝糖肽提取率卻呈逐漸下降趨勢；當(dāng)提取時間為5 h時，提取率呈逐漸穩(wěn)定趨勢。為了獲得較高的提取率，并且提高提取效率，本研究選擇提取時間為2 h。

2.4 料水比對云芝糖肽提取率的影響

考察了提取云芝糖肽的過程中，不同料水比對云芝糖肽提取效果的影響。試驗結(jié)果表明：當(dāng)料水比從1︰3遞增至1︰6時，云芝糖肽提取率隨著料水比的增加而增大；當(dāng)料水比為1︰6時，提取率最高，為48.6 mg/g；當(dāng)料水比繼續(xù)增大時，云芝糖肽提取率卻呈逐漸下降趨勢。為了獲得較高的提取率，并且降低濃縮工藝，本研究選擇料水比為1︰6。

2.5 提取次數(shù)對云芝糖肽提取率的影響

考察了提取次數(shù)對云芝糖肽提取率的影響。試驗結(jié)果表明：當(dāng)提取次數(shù)為1次時，提取率約占總量的86.0%；當(dāng)提取次數(shù)為2次時，提取率約占總量的96.7%；當(dāng)提取次數(shù)為3次時，提取率約占總量的98.6%。繼續(xù)增加提取次數(shù)時，會消耗能源和成本，并增加后續(xù)工藝難度，故選擇提取次數(shù)為2次。

3 結(jié)論

本文建立了水提醇沉提取純化云芝糖肽的方法，研究發(fā)現(xiàn)：高壓均質(zhì)法破碎云芝菌絲體比勻漿法處理效果好；水提醇沉提取工藝最佳條件為：料水比1︰6，提取溫度80 ℃，提取時間2 h，提取次數(shù)2次。

[1]李巖,周藝,楊鳳瓊,等.一種云芝糖肽的提取及分級提純工藝：CN 104262503A[P].2015-01-07.