支氣管哮喘患者血清相關(guān)miRNAs的檢測及其意義

孫海霞+張洪欽+劉波泉

[摘要] 目的 探討支氣管哮喘患者血清中miRNAs表達(dá)譜改變情況，從中發(fā)現(xiàn)與支氣管哮喘相關(guān)的miRNAs。 方法 選擇2014年8月～2015年10月在解放軍四二一醫(yī)院確診的48例哮喘急性發(fā)作期患者為哮喘組，另選擇同期醫(yī)院體檢科健康體檢者40例為對照組。通過miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，對兩組血清中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行檢測，篩選得到的miRNAs通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證。 結(jié)果 哮喘組患者血清miR-155、miR-150和miR-145的表達(dá)明顯高于對照組（P < 0.05）；而miR-34b-5p的表達(dá)則明顯低于對照組（P < 0.05）。 結(jié)論 支氣管哮喘患者血清中miRNAs表達(dá)譜發(fā)生明顯變化，提示血清miRNAs可能作為是支氣管哮喘的檢測指標(biāo)，也可能作為未來哮喘治療的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] miRNA芯片；支氣管哮喘；血清

[中圖分類號] R562.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0058-03

Detection and clinical significance of miRNAs in serum of patients with bronchial asthmaandits

SUN Haixia1 ZHANG Hongqin1 LIU Boquan2

1.Department of Geriatrics， Hospital No.421 of PLA， Guangdong Province， Guangzhou 530318， China； 2.Physical Examination Center， Guangdong Second People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 530318， China

[Abstract] Objective To investigate changes of expression profile of miRNAs in serum of patients with bronchial asthma， in order to discover the miRNAs related to bronchial asthma. Methods From August 2014 to October 2015， in Hospital No.421 of PLA， 48 patients diagnosed with acute asthma were selected as asthma group， 40 healthy persons had physical examination at the same period were selected as control group. Expression of miRNAs in serum of patients with bronchial asthma and healthy controls were detedted by miRNA microarray technique， and miRNAs obtained by screening were validated by real time fluorescent quantitative RT-PCR. Results The expression of miR-155， miR-150 and miR-14 in serum of asthma group were higher than control group （P < 0.05）； and the expression of miR-34b-5p was lower than control group （P < 0.05）. Conclusion The expressing profile of miRNAs in serum of patients with bronchial asthma changed significantly， indicating that serum miRNAs can be used as detecting parameter for bronchial asthma and may also serve as new targets in the treatment of asthma in the future.

[Key words] miRNA microarray； Bronchial asthma； Serum

支氣管哮喘（簡稱“哮喘”）是指由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與而引起的慢性氣道炎癥。近年來哮喘患病率在全球呈逐年上升的趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有約1.6億哮喘患者，我國的哮喘患病率為1%～4%。哮喘的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為由于各種致病因素導(dǎo)致的細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)失衡是哮喘發(fā)病最主要的致病機(jī)制[2]。非編碼小分子RNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈小分子RNA，長度20～25 nt，多存在與動植物體真核細(xì)胞內(nèi)，能夠特異性地降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯[3]。已有研究表明，miRNA廣泛參與調(diào)控各種生理病理的生物學(xué)進(jìn)程[4-5]。此外，疾病患者血清中miRNA表達(dá)譜和表達(dá)水平的改變也能反映許多疾病的病理過程[6]。通過miRNA芯片技術(shù)對哮喘患者血清中miRNAs表達(dá)譜情況的檢測，為miRNA在哮喘發(fā)病中的分子機(jī)制及潛在的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年8月～2015年10月解放軍第四二一醫(yī)院確診的48例哮喘急性發(fā)作期患者的血清樣本作為哮喘組。所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會2008年制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。其中男17例，女31例，平均年齡（37.6±12.8）歲。所有哮喘患者在研究期間無肺炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺間質(zhì)性疾病、自身免疫性疾病及其他系統(tǒng)炎癥疾病，均無吸煙史或者戒煙至少2年，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值百分?jǐn)?shù)為（75±21）%，且皮膚過敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)均為陽性。另選擇同期醫(yī)院體檢科健康體檢者40例為對照組，其中男13例，女27例，平均年齡（38.2±10.5）歲。兩組資料在性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有血清樣本在采集前均向受試者說明研究目的并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

MiScript Reverse Transcription Kit（Qiagen公司，德國）；MirVanaTM miRNA Isolation Kit（Ambion公司，美國）；miRNA芯片（v 1.0）（Exiqon公司，丹麥）；miR-155、miR-150、miR-145、miR-34b-5p及U6引物序列購于天根生化科技（北京）技術(shù)有限公司；ABIprism 7900HT PCR儀（Applied Biosystems公司， 美國）。

1.3 血清標(biāo)本采集

所有患者于清晨空腹采集5 mL外周靜脈血，室溫靜置1 h后3000 r/min，離心15 min，離心半徑1 cm，取上清并于-80°C冰箱保存待測。

1.4 miRNA表達(dá)譜芯片檢測

①采用試劑盒提取總RNA和miRNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。②探針制備：miRCURYR Array Power 標(biāo)記試劑盒標(biāo)記Hy3TM：熒光基團(tuán)，制備miRNA熒光標(biāo)記探針。③miRNA芯片雜交：探針和miRCURYR芯片雜交在PhalanxTM熱收縮雜交袋內(nèi)進(jìn)行，芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)納入MeV 4.0軟件進(jìn)行聚類分析。

1.5 RT-PCR驗(yàn)證

對miR-155、miR-150、miR-145和miR-34b-5p的基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。Trizol法抽提樣品總RNA，stem-loop進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件如下：16°C，30 min；42 °C，40 min；85 °C，5 min。RT-PCR反應(yīng)按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95°C，10 min；40個(gè)PCR循環(huán)（95°C，15 s；60°C，30 s；72°C，30 s），擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后以每5秒升高1°C的速度繼續(xù)緩慢加熱到99°C，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，U6 snRNA為內(nèi)參，2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（CT值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組實(shí)驗(yàn)對象血清中miR-155、miR-150、miR-145和miR-34b-5p的表達(dá)水平存在顯著差異，見表1。結(jié)果顯示：哮喘組患者血清miR-155、miR-150和miR-145的表達(dá)上較對照組明顯上調(diào)（P < 0.05）；而 miR-34b-5p的表達(dá)則明顯下調(diào)（P < 0.05）。

3 討論

哮喘的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前還不完全清楚，主要包括：變態(tài)反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性、氣道慢性炎癥、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)失常、遺傳機(jī)制、神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和氣道重構(gòu)及其相互作用等。目前哮喘的診斷主要靠臨床表現(xiàn)和肺功能檢測，缺乏預(yù)見性和前瞻性。哮喘的治療主要通過吸入激素和其他藥物（如β2-受體激動劑）的抗炎和解除支氣管痙攣，從而緩解哮喘癥狀。然而這些藥物需長期使用且具有一定的副作用[8]。因此，如何深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而尋找更有效的治療手段，是目前研究的熱點(diǎn)。

對miRNA結(jié)構(gòu)與功能的深入研究表明，miRNA參與真核細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)的調(diào)節(jié)途徑。在人體腫瘤發(fā)病機(jī)制、生理病理過程起重要作用，這對于人類腫瘤發(fā)病機(jī)制和診治提出新的思路[9-11]。近年來，miRNA在哮喘發(fā)病過程中的作用日益受到重視。Dragon等[12]使用miRNA芯片對比檢測健康者及輕度哮喘患者肺組織miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-92、miR-26a、miR-200c、let-7b、mi-16、miR-125a和miR-125b在哮喘患者肺組織中為高表達(dá)，提示這些miRNAs可能是調(diào)控氣道及肺組織相關(guān)基因表達(dá)的miRNA。有研究表明，miRNA-155在T細(xì)胞向Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞的分化過程中起了關(guān)鍵作用。且miR-155可以通過下調(diào)白介素-13al受體的表達(dá)以調(diào)控IL-13通路，因此推測miR-155可能通過其明顯的抗炎作用調(diào)控哮喘的發(fā)病過程[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血清中的表達(dá)水平穩(wěn)定，但在人體處于疾病狀態(tài)下時(shí)其表達(dá)水平出現(xiàn)異常[15-16]。因此，miRNA及其調(diào)控的基因的表達(dá)差異可作為疾病的檢測指標(biāo)[17]，也有助于疾病的治療[18-19]。本研究采用基于LNATM技術(shù)的捕獲探針對支氣管哮喘患者血清中miRNAs表達(dá)譜改變情況進(jìn)行檢測分析。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：兩組實(shí)驗(yàn)對象血清中miR-155、miR-150、miR-145和miR-34b-5p的表達(dá)水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05），哮喘組患者血清miR-155、miR-150和miR-145的表達(dá)上較對照組明顯上調(diào)（P < 0.05）；而miR-34b-5p的表達(dá)則明顯下調(diào)（P < 0.05），提示血清miRNA不僅可以作為哮喘患者的血清學(xué)檢測指標(biāo)，也可能參與哮喘發(fā)病過程的調(diào)控，甚至可能作為未來哮喘治療的新靶點(diǎn)[20-21]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Al-Ani S，Spigt M，Laue J，et al. Predictors of treatment with antibiotics and systemic corticosteroids for acute exacerbations of asthma and chronic obstructive pulmonary disease in primary care [J]. Bmc Family Practice，2015，16（1）：1-10.

[2] Aalbers R，Vogelmeier C，Kuna P. Achieving asthma control with ICS/LABA： A review of strategies for asthma management and prevention [J]. Respir Med，2016，111：1-7.

[3] 張毅.腹部創(chuàng)傷應(yīng)激后血清microRNA表達(dá)改變及其意義[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2011.

[4] 千年松，楊凡，印凡，等.大鼠腹部手術(shù)應(yīng)激后血清 miRNA 表達(dá)譜的差異分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23（9）：1201-1204.

[5] 成炳祥，方煊，朱承良，等.索拉非尼對肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNAs的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（9）：41-44.

[6] Fabian MR，Sonenberg N，F(xiàn)ilipowicz W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs [J]. Annu Rev Biochem，2010，79：351-379.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南（支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案）[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31（3）：177-185.

[8] Albertson T E，Schivo M，Gidwani N，et al. Pharmacotherapy of critical asthma syndrome： current and emerging therapies [J]. Clin Rev Allergy Immunol，2015， 48（1）：7-30.

[9] 尹凌帝，孫倩，孫明，等.人類癌癥中長鏈非編碼RNA與miRNA相互作用的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2014（7）：662-666.

[10] Wu XB，Wang MY，Zhu HY，et al. Overexpression of microRNA-21and microRNA-126 in the patients of bronchial asthma [J]. Int J Clin Exp Med，2014，7（5）：1307-1312.

[11] Perry MM，Baker JE，Gibeon DS，et al. Airway smooth musclehy perproliferation is regulated by microRNA-221 in severe asthma [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2014，50（1）：7-17.

[12] Dragon S，Hirst SJ，Lee TH，et al. IL-17A mediates a selective gene expression profile in asthmatic human airway smooth muscle cells [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2014，50（6）：1053-1063.

[13] Kurowska-Stolarska M，Alivernini S，Ballantine L E，et al. MicroRNA-155 as a proinflammatory regulator in clinical and experimental arthritis [J]. PNAS，2011，108（27）：11193-11198.

[14] Suojalehto H，Toskala E，Kilpelinen M，et al. MicroRNA profilesin nasal mucosa of patients with allergic and nonallergic rhinitis and asthma [J]. Int Forum Allergy Rhinol，2013，3（8）：612-620.

[15] 張亞偉，宮路路，趙鵬，等.橋本甲狀腺炎和甲狀腺乳頭狀癌miRNAs表達(dá)差異研究[J].中國地方病防治雜志，2015，30（3）：223-224.

[16] 郭曉東，周光德，楊美，等.肝癌患者血清乙肝病毒特異性miRNAs水平指標(biāo)檢測與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究[C]//中華醫(yī)學(xué)會第十六次全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編，2013：1742-1744.

[17] 柳新勝.血清miRNA-192評估呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者病情嚴(yán)重度及結(jié)局轉(zhuǎn)歸的臨床價(jià)值[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（4）：53-55.

[18] Zheng G，Du L，Yang X，et al. Serum microRNA panel as biomarkers for early diagnosis of colorectal adenocarcinoma [J]. British J Cancer，2014，111（10）：1985-1992.

[19] 劉蘭英，周姍，王和生.微RNA 在支氣管哮喘中與Th2相關(guān)促炎因子的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（33）：4252-4255.

[20] Greene CM，Gaughan KP. microRNAs in asthma： potential therapeutic targets [J]. Curr Opin Pulm Med，2013，19（1）：66-72.

[21] Winkler C，Bahlmann O，Viereck J，et al. Impact of a Met（11） Thrsingle nucleotide polymorphism of surfactant protein D on allergicairway inflammation in a murine asthma model [J]. Exp Lung Res，2014，40（4）：154-163.

（收稿日期：2016-12-14 本文編輯：蘇 暢）