乳癌術(shù)后方HPLC特征圖譜研究

邵士珺+吳雪卿+萬華+杜若飛+馮怡

[摘要] 目的 建立臨床有效驗(yàn)方乳癌術(shù)后方的HPLC特征圖譜。 方法 使用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長270 nm；以上述方法制備乳癌術(shù)后方提取液，獲得特征峰，檢測上述制備方法的重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和相似度。 結(jié)果 該方法重復(fù)性相對保留時(shí)間的RSD分別為0.06%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，精密度相對保留時(shí)間的RSD分別為0.09%、0.02%、0.02%、0.008%、0.05%，穩(wěn)定性相對保留時(shí)間的RSD分別為0.08%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，均良好。采用該方法測定3批次乳癌術(shù)后方，均標(biāo)示出6個(gè)共有峰，且相似度均高于95%。 結(jié)論 該研究為乳癌術(shù)后方的進(jìn)一步物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量評價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 乳癌術(shù)后方；HPLC；特征圖譜

[中圖分類號] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0004-05

HPLC specific chromatogram of Ru'ai Shuhou Recipe

SHAO Shijun1 WU Xueqing1 WAN Hua1 DU Ruofei2 FENG Yi2

1.Department of Galactophore， Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200021， China； 2.Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

[Abstract] Objective To establish the specific chromatogram of clinically proved effective Ru'ai Shuhou Recipe. Methods Agilent Extend-C18 cloumn （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was adopted， with acetonitrile and water containing 0.05% phosphoric acid as the mobile phase， and the flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was set at 25℃， and the detection wavelength was 270 nm. This method was used to prepare the extract of Ru'ai Shuhou Recipe， and obtain specific chromatographic peaks. Meanwhile the repeatability， precision， stability and similarity were detect by this method. Results Good repeatability （RSD relative retention time were 0.06%， 0.03%， 0.02%， 0.02%， 0.04%）， precision （RSD relative retention time were 0.09%， 0.02%， 0.02%， 0.008%， 0.05%） and stability （RSD relative retention time were 0.08%， 0.03%， 0.02%， 0.02%， 0.04%） were proved. Three batches of Ru'ai Shuhou Recipe all showed 6 common specific chromatographic peaks with similarities above 0.95. Conclusion The study lays a foundation for the further study of material basis and quality evaluation of Ru'ai Shuhou Recipe.

[Key words] Ru'ai Shuhou Recipe； HPLC； Specific chromatogram

乳癌術(shù)后方是上海市名中醫(yī)陸德銘教授經(jīng)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，長期運(yùn)用于乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床防治工作中，取得了良好的臨床療效。該方由黃芪、白術(shù)、茯苓、淫羊藿、山萸肉、莪術(shù)、蜂房組成，7味藥同用益腎健脾、活血解毒，共奏扶正祛邪、標(biāo)本同治之功。

乳癌術(shù)后方已申請專利并獲批[1]，針對該方開展了大量臨床研究，發(fā)現(xiàn)其能夠有效預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延長患者的生存期[2-4]，同時(shí)能夠明顯提高乳腺癌患者的生活質(zhì)量，改善患者的免疫功能[3]。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)乳癌術(shù)后方可以通過HER2介導(dǎo)的多途徑調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制因子（TIMPs）的表達(dá)，通過加強(qiáng)腫瘤周圍正常組織細(xì)胞的防御能力，抵御惡性腫瘤細(xì)胞對周圍基質(zhì)的侵蝕而發(fā)揮抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作用[5-7]。然而，由于尚未建立該方的HPLC特征圖譜，無法了解該中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)與發(fā)揮療效的主要化學(xué)成分群，為進(jìn)一步的質(zhì)量控制及制劑開發(fā)帶來了困難。因此，本研究旨在建立乳癌術(shù)后方HPLC特征圖譜，為該方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；十萬分之一天平（瑞士MettlerToledo）；萬分之一天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）；PTHW電熱套（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。乙腈和甲醇為色譜純（上海星可生化有限公司），水為超純水（Milli-Q型純水儀，購自密理博中國有限公司），其他試劑均為分析純。對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201203），淫羊藿苷（批號：110737-200415）均購于中國食品藥品檢定研究院。3批次乳癌術(shù)后方復(fù)方藥材飲片購自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，所有飲片均符合《中國藥典》2015版一部項(xiàng)下的質(zhì)量要求。分析軟件使用的是中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版（國家藥典委員會(huì)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品10.304 mg，用甲醇配制濃度分別為515.2 μg/mL和5.152 μg/mL毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液。精密稱取淫羊藿苷對照品10.62 mg，用甲醇配制濃度分別為1062 μg/mL和106.2 μg/mL淫羊藿苷對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

按照處方比例稱取黃芪10 g，白術(shù)6 g，茯苓6 g，淫羊藿10 g，山萸肉6 g，莪術(shù)10 g和蜂房10 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，分別加水500 mL和250 mL，回流提取2次，每次30 min，提取液合并后過濾，減壓濃縮至約100 mL，即為供試品。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.3.1 檢測波長的確定 選擇乳癌術(shù)后方中3味藥材黃芪、淫羊藿和白術(shù)的指標(biāo)性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的檢測波長270、260、220 nm為供試品特征圖譜的檢測波長，檢測結(jié)果見圖1。比較3個(gè)波長下的特征圖譜，270 nm的特征譜分離度更高，基線更為平坦，因此選擇270 nm作為樣品的檢測波長。

2.3.2 流動(dòng)相的確定 取供試品溶液（批號20141208，下同），參照文獻(xiàn)[8]中毛蕊異黃酮葡萄糖及2015版《中國藥典》[9]中淫羊藿苷測定方法，以乙腈-磷酸溶液作為基礎(chǔ)流動(dòng)相，考察0.04%、0.05%、0.06%磷酸溶液時(shí)的特征圖譜。如圖2所示，三者圖譜差距不大，最終選擇文獻(xiàn)[8]中采用的0.05%磷酸溶液。

2.3.3 流速的確定 取供試品溶液，分別用0.9、1.0和1.1 mL/min的流速進(jìn)行測定。如圖3所示，當(dāng)流速為1.1 mL/min時(shí)，一些色譜峰的分離效果不佳，且柱壓較高；而流速為0.9 mL/min時(shí)，對照其他兩張圖譜可見在60 min時(shí)仍有成分未出峰。因此，選擇1.0 mL/min作為測定流速。

2.3.4 梯度條件的確定 采用表1所示梯度程序洗脫法發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離度較好，淫羊藿苷分離度差?？紤]在13 min和32 min減緩梯度變化，保留了15 min前分離毛蕊異黃酮葡萄糖苷的梯度條件，調(diào)整后續(xù)淫羊藿苷的梯度條件見表2。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷分離度均較好，但60 min后仍有成分流出，因此，做進(jìn)一步梯度調(diào)整，解決出峰不完全的問題，見表3。結(jié)果如圖4所示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷分離度均較好，且已解決60 min出峰不完全的問題。因此，確定該梯度為最終梯度。

2.3.5 檢測色譜條件的確定 乳癌術(shù)后方特征圖譜的檢測條件為：使用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.05%磷酸溶液三元梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為270 nm。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷和淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.3.6 特征峰的確定 供試品特征圖譜中應(yīng)有6個(gè)特征峰，與參照物淫羊藿苷相應(yīng)的峰為S峰，毛蕊異黃酮葡萄糖苷為峰1，特征圖譜見圖5。

2.4 分析方法驗(yàn)證

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批乳癌術(shù)后方提取液供試品（批號20141208，下同）6份，按上述色譜條件制備供試品溶液，分別測定6個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間，結(jié)果1、2、3、4、6號峰與參照物S峰（5號峰）的相對保留時(shí)間RSD分別為0.06%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，重復(fù)性良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定6個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間，結(jié)果1、2、3、4、6號峰與參照物S峰（5號峰）的相對保留時(shí)間RSD分別為0.09%、0.02%、0.02%、0.008%、0.05%，進(jìn)樣精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品，自制備后，按上述擬定色譜條件方法操作，分別在0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測定6個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間，結(jié)果1、2、3、4、6號峰與參照物S峰（5號峰）的相對保留時(shí)間RSD分別為0.08%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定[10]。

2.4.4 三批乳癌術(shù)后方提取液特征圖譜的測定 取三批乳癌術(shù)后方提取液（批號分別為20141208、20150302-1、20150302-2）按擬定特征圖譜測定方法操作，測定結(jié)果見表4、圖6。由表4可知，三批圖譜與對照圖譜的相似度均高于95%。

3 討論

為臨床有效的經(jīng)驗(yàn)方建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是對臨床療效進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證的必經(jīng)之路，也是進(jìn)一步開發(fā)中藥新藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可以是單體化合物、有效部位以及中藥復(fù)方提取物[12-14]。筆者認(rèn)為采用水提工藝制備制劑原料，可以使其有效成分盡可能與臨床用藥接近，是重現(xiàn)原方療效的有效途徑。然而，該條件下制備的中藥制劑原料主要為多成分的混合物，這給質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的制訂提出了更高的要求。目前，建立復(fù)方中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法主要有指標(biāo)成分檢測、特征圖譜等[15-16]。指標(biāo)成分檢測可以很好地對某味藥物或化合物建立定性、定量的標(biāo)準(zhǔn)來開展質(zhì)量監(jiān)控，但中藥制劑尤其是復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)整合作用的特點(diǎn)，進(jìn)行單指標(biāo)成分質(zhì)量控制顯然不具備代表性，多指標(biāo)成分分析可以解決代表性不足的問題，但在有效成分無法明確的情況下應(yīng)用就會(huì)受限[17]。相比之下，建立特征圖譜可以較為全面地反映中藥制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，尤其是在復(fù)方制劑中有效成分大部分未明確的情況下，能較全面地反映中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量[18-21]。因此，本研究選擇建立特征圖譜的方法以期更加全面準(zhǔn)確地反映乳癌術(shù)后方復(fù)發(fā)制劑的主要原料成分。

在選擇指紋圖譜指標(biāo)成分時(shí)，筆者查閱了藥典及相關(guān)文獻(xiàn)。乳癌術(shù)后方由黃芪、茯苓、淫羊藿、肉蓯蓉、莪術(shù)、蜂房、石見穿7味藥物組成，其中，石見穿未被藥典收載，白術(shù)、茯苓、莪術(shù)三味藥材在藥典中無明確的指標(biāo)成分含量檢測要求。在進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)后，初步將黃芪的指標(biāo)成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷，白術(shù)的指標(biāo)性成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，淫羊藿的指標(biāo)成分淫羊藿苷，肉蓯蓉的指標(biāo)成分松果菊苷、毛蕊花糖苷作為指紋圖譜備選指標(biāo)成分。其中，黃芪甲苷需要使用HPLC的ESLD檢測器檢測，其他指標(biāo)成分均使用紫外檢測器，因此首先被排除。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的檢測波長為270 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的檢測波長為220 nm，淫羊藿苷的檢測波長為260 nm，松果菊苷、毛蕊花糖苷的檢測波長為330 nm。因此，最終選擇檢測波長相近的毛睿異黃酮葡萄糖苷和淫羊藿苷作為指紋圖譜的指標(biāo)性成分。

乳癌術(shù)后方特征圖譜的建立為進(jìn)一步物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了理論依據(jù)。但是，目前所建立的特征圖譜中運(yùn)用的樣品數(shù)量較少，尚無法作為乳癌術(shù)后方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在后續(xù)研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，建立指紋圖譜，從而為該復(fù)方制劑的藥物研發(fā)及臨床推廣應(yīng)用提供切實(shí)可行的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 萬華，吳雪卿，馮佳梅，等.一種治療乳腺癌的藥物制劑及其制備方法：中國，CN200810200115.X [P]. 2012-09-12.

[2] 高晴倩，萬華，李欣榮，等.乳癌術(shù)后方對乳腺癌術(shù)后患者無病生存期的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志，2011，45（10）：49-52.

[3] 瞿文超，吳雪卿，馮佳梅，等.中藥復(fù)方對乳腺癌患者5年無病生存率及總生存率的影響[J].中醫(yī)中藥，2012，9（36）：120-122.

[4] 董佳容，萬華，周阿高.“乳癌術(shù)后方”對乳腺癌術(shù)后患者臨床癥狀及免疫功能的影響[J].光明中醫(yī)，2008，23（12）：1886-1888.

[5] 吳雪卿，邵士珺，瞿文超，等.乳癌術(shù)后方對HER2陽性乳腺癌復(fù)方轉(zhuǎn)移中基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（11）：1526-1530.

[6] 邵士珺，吳雪卿，馮佳梅，等.乳癌術(shù)后方對HER2過表達(dá)乳腺癌小鼠復(fù)方轉(zhuǎn)移中HER2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)基質(zhì)蛋白表達(dá)的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志，2013，47（6）：89-92.

[7] 廖明娟， 王永靈， 李琰，等.乳癌術(shù)后方及其拆方對乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠Foxp3、TGF-β1、CD4+的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志，2015，49（7）：77-81.

[8] 石子儀，鮑忠，姜勇，屠鵬飛.不同來源黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析[J].中國中藥雜志，2007，32（9）：779-783.

[9] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：327-328.

[10] 甘為，陳金鳳，馬桂芝.反相HPLC法測定復(fù)方芍紅顆粒中芍藥苷含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（18）：138-141.

[11] 鄺婷婷，王宇，王張，等.藏藥蔓菁膏抗缺氧作用的量-效/毒關(guān)系及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國中藥雜志，2016，41（4）：597-602.

[12] 郭倩，田成旺，任濤，等.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（3）：648-654.

[13] 張愛華，孫暉，閆廣利，等.中藥有效性評價(jià)與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（5）：719-723.

[14] 楊鳴華，劉祎，孔令義.基于中藥有效單體成分的新藥研究[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（3）：329-336.

[15] 胥愛麗，董玉娟，江潔怡，等.何首烏配方顆粒的UPLC指紋圖譜及化學(xué)成分歸屬[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016， 22（2）：47-50.

[16] 梁小銀，陳少旭，吳垠.中藥制劑質(zhì)量控制研究的發(fā)展趨勢[J].中國藥房，2014，25（3）：280-283.

[17] 王偉，楊素德，李家春，等.銀翹清熱片HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2016，47（11）：1882-1889.

[18] 劉靜，周曉梅，祝與鳴，等.中藥質(zhì)量控制方法研究進(jìn)展[J].中國藥房，2010，21（3）：281-282.

[19] 張海弢，徐振秋，付娟，等.怡康片指紋圖譜研究和兩個(gè)指標(biāo)成分定量測定[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（1）：101-105.

[20] 李文靜，張昊，于慶蓮，等.基于聚類和主成分分析的紅花抗肝纖維化提取物特征圖譜研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（12）：17-20.

[21] 梁璐.白芷飲片的薄層鑒別和指紋圖譜研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（12）：139-142.

（收稿日期：2017-01-09 本文編輯：程 銘）