草莓果腐敗霉菌的分離、鑒定及其防腐方法探索

楊茜然，顧曉穎，張?jiān)凭?，汪雯，李凌飛

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201）

草莓果腐敗霉菌的分離、鑒定及其防腐方法探索

楊茜然，顧曉穎，張?jiān)凭?，汪雯，李凌飛*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201）

目的：對(duì)草莓果上的腐敗霉菌進(jìn)行分離鑒定，并探索其防腐方法，為草莓的保鮮、貯藏及深加工過(guò)程中有目的地控制霉菌提供合理有效的依據(jù)。方法：采用傳統(tǒng)平板法分離草莓果上的霉菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合DNA序列分析方法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果：引起草莓果腐敗的霉菌主要是普通青霉（Penicillium commune）、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）、奧爾森青霉（Penicillium olsonii）、小刺青霉（Penicillium spinulosum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、深綠木霉（Trichoderma atroviride）、尖小叢殼菌（Glomerella acutata）及擬盤多毛孢（Pestalotiopsis sp.）。同時(shí)，采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液處理結(jié)合低溫冷藏技術(shù)對(duì)草莓果上的微生物進(jìn)行抑制，結(jié)果表明使用0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低溫冷藏抑菌效果最好。結(jié)論：引起草莓果腐敗變質(zhì)的霉菌主要包括5個(gè)屬9個(gè)種，其中青霉屬是引起草莓果腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌群。通過(guò)比較幾種保鮮方法，表明0.05%的山梨酸溶液處理是一種較為理想的草莓果貯藏保鮮方法。

草莓；霉菌；鑒定；抑制

草莓（Fragaia ananassa Duch.）是薔薇科草莓屬的多年生草本植物。果實(shí)色澤鮮艷，果肉柔軟多汁，酸甜可口，老少皆宜，深受消費(fèi)者喜愛。草莓富含維生素，有機(jī)酸以及礦質(zhì)元素，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食療作用〔1〕，享有“水果皇后”之美譽(yù)。草莓果實(shí)為漿果，果皮極薄，組織嬌嫩，在采摘后的貯藏運(yùn)輸過(guò)程中極易受到機(jī)械損傷；并且草莓含水多，含糖量高，是多種微生物的天然培養(yǎng)基。因此草莓在儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，極易受到微生物污染，不僅導(dǎo)致草莓快速腐敗變質(zhì)，也帶來(lái)了食用安全問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)草莓微生物的研究主要集中在草莓栽培過(guò)程中一些微生物病害〔2-3〕，關(guān)于草莓采后果實(shí)上微生物種群組成的研究較少。潘見等〔4〕對(duì)采摘后的草莓進(jìn)行衛(wèi)生微生物檢查，從中分離到了8科10屬16種細(xì)菌。李枝文〔5〕從草莓發(fā)酵液中分離到了2株酵母菌。然而，目前對(duì)草莓采后腐敗變質(zhì)的霉菌研究甚少。本研究在傳統(tǒng)微生物分離純化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)草莓果上的霉菌進(jìn)行分類鑒定，同時(shí)探討草莓果上腐敗霉菌的抑制方法，從而為草莓的保鮮、貯藏及深加工過(guò)程中有目的地控制微生物提供合理有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料草莓果分別采自昆明市西山區(qū)和玉溪市紅塔區(qū)草莓種植基地，隨機(jī)抽樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 霉菌的分離霉菌的分離采用兩種方法：一是按照國(guó)標(biāo)GB 4789.15-2010方法，用孟加拉紅培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)72 h分離草莓果上的霉菌。二是將采來(lái)的新鮮草莓果放至自然腐敗變質(zhì)，從已發(fā)霉的草莓果上直接挑取霉菌菌絲進(jìn)行分離純化。所分離的霉菌用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）進(jìn)行純化后，挑取單菌落進(jìn)行保存。

1.3 霉菌的分類鑒定

1.3.1 霉菌的形態(tài)學(xué)觀察根據(jù)常用的霉菌鑒定方法，通過(guò)觀察霉菌的形態(tài)特征，對(duì)照《真菌分類學(xué)》〔6〕對(duì)霉菌進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2總DNA的提取根據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定的結(jié)果，選擇代表菌株，利用CTAB法（石英砂研磨）〔7〕提取真菌基因組DNA。

1.3.3 PCR條件通過(guò)真菌通用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對(duì)ITS（包括5.8S）區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×Premix Taq（TaKaRa）25μL，DNA模板2μL，引物（10μmol∕L）各2μL，去離子水補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min。

1.3.4 DNA序列分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。所獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選取同源性較高的已知菌株的ITS序列和所測(cè)菌株的序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Mega 4.0軟件中鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 草莓果防腐方法探索將采來(lái)的新鮮草莓果采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液處理后分別在室溫和4℃低溫條件下儲(chǔ)存，每種處理做3個(gè)平行，每一平行的樣本數(shù)為20顆草莓。每天定時(shí)觀察草莓的腐敗變質(zhì)情況，記錄每一處理中變質(zhì)草莓果的顆粒數(shù)以及外觀變化，利用腐爛率來(lái)衡量抑制效果（腐爛率：用累積法統(tǒng)計(jì)，以腐爛顆數(shù)占果實(shí)總數(shù)的百分比表示）。見表1。

表1 草莓果的防腐方法

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于各處理方法的防腐效果比較，兩兩比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)、三組及三組以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌的形態(tài)學(xué)特征及其鑒定結(jié)果經(jīng)分離純化，得到9種霉菌單菌落，其形態(tài)特征及鑒定結(jié)果如下：CF8菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落局限生長(zhǎng)，具幾道同心環(huán)或無(wú)同心環(huán)，無(wú)滲出液。產(chǎn)生較多小分生孢子，分生孢子面灰綠色，呈球形或近球形，鏈狀排列，孢壁平滑；分生孢子梗壁光滑，帚狀枝雙輪生，叉開。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為普通青霉（Penicillium commune）。

CF14菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落局限生長(zhǎng)，有大量放射狀皺紋；菌絲體白至微黃色，有大量黃色滲出液；菌落反面呈黃褐色，產(chǎn)生大量淡黃色可溶性色素。產(chǎn)生大量小分生孢子，分生孢子面藍(lán)綠色，呈橢圓形或近球形，鏈狀排列，孢壁光滑；分生孢子梗壁光滑，帚狀枝三輪生，少量為兩輪生，稍叉開；結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）。

CF9菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落具有放射狀皺紋，質(zhì)地絨狀，無(wú)滲出液。菌落反面灰綠色，無(wú)可溶性色素。產(chǎn)生大量小分生孢子，灰綠色，呈橢圓形，鏈狀排列，孢壁光滑；分生孢子梗壁平滑；帚狀枝通常三輪生，?；o貼。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為奧爾森青霉（Penicillium olsonii）。

TF18菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落局限生長(zhǎng)，具有放射狀皺紋；菌絲體白色，無(wú)滲出液；菌落反面呈淡黃色，無(wú)可溶性色素。產(chǎn)生大量小分生孢子，分生孢子面藍(lán)綠色，呈球形或近球形，鏈狀排列，孢壁上具有明顯的刺狀突起；分生孢子梗壁平滑，帚狀枝單輪生，偶有雙輪生。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為小刺青霉（Penicillium spinulosum）。

TF16菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落有放射狀的溝紋；菌落中央呈土褐色，邊緣白色，無(wú)滲出液；菌落反面呈棕褐色。產(chǎn)生大量小分生孢子，呈球形或近球形，孢壁光滑；分生孢子囊直柱形，頂囊半球形；小梗雙層，排列緊密，布滿頂囊表面的2∕3。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為土曲霉（Aspergillus terreus）。

CF12菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)迅速，有少量同心輪紋；菌落開始為白色，2～3 d后轉(zhuǎn)為灰綠色，無(wú)滲出液；菌落反面呈淺綠色。產(chǎn)生大量小分生孢子，呈球形，鏈狀排列，孢壁上有粗糙突起；分生孢子頭圓柱狀，頂囊綠色，燒瓶狀；小梗單層，布滿頂囊表面的3∕4。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

CF10菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)迅速，初期為白色絨狀，后期轉(zhuǎn)為綠色至深綠色。產(chǎn)生小分生孢子，多為卵圓形，無(wú)色或綠色，簇生于小梗頂端，表面有刺突；分生孢子梗是菌絲的短側(cè)枝，側(cè)枝上對(duì)稱或互生分枝，形成二級(jí)和三級(jí)分枝，在分枝末端形成瓶狀小梗。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為深綠木霉（Trichoderma atroviride）。

CF19菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌絲初期呈白色，后期顏色加深，變?yōu)榧t灰色，有同心輪紋。小分生孢子盤黑色、圓形或近圓形，較稀疏，分生孢子梭狀、單孢；剛毛密集，有分隔，基部膨大；分生孢子梗分枝。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為尖小叢殼菌（Glomerella acutata）。

TF5菌株：在PDA培養(yǎng)基上，菌落初期為白色，后期變?yōu)榈稚?，具有輪狀條紋；菌落背面呈土黃色。產(chǎn)生大分生孢子，呈紡錘形，直或略彎曲，由5個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，中間3個(gè)細(xì)胞褐色，并且3個(gè)細(xì)胞不同色，兩端細(xì)胞無(wú)色；頂部細(xì)胞圓錐形，有2根頂端附屬絲；具有分生孢子盤。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）。見圖1。

2.2 草莓果防腐方法探索結(jié)果分別在室溫和4℃低溫貯存條件下，采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液對(duì)草莓果上的霉菌進(jìn)行抑制，測(cè)定草莓果的保鮮效果。見表2。

表2 不同防腐處理后草莓的腐爛率（%）

圖1 草莓果霉菌的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

研究結(jié)果表明，4℃低溫貯存保鮮效果明顯優(yōu)于常溫條件（P＜0.05）。通過(guò)比較不同防腐處理方法，可以看出，4℃低溫貯藏保鮮條件下，山梨酸溶液處理后草莓腐爛率顯著低于紫外照射和植酸溶液處理（P＜0.05）；且0.05%、0.10%和0.15%的山梨酸鉀溶液處理效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故從成本及限量標(biāo)準(zhǔn)考慮，0.05%的山梨酸溶液處理是一種較為理想的草莓貯藏保鮮方法。

3 討論

草莓果極不耐貯運(yùn)，常溫下存放1～2 d就會(huì)變色變味，開始腐爛變質(zhì)〔8-9〕。因此，對(duì)草莓果上的微生物進(jìn)行檢查與鑒定，并有針對(duì)性地研究適宜的草莓貯藏保鮮技術(shù)顯得尤為重要。草莓果上的微生物十分豐富，其微生物區(qū)系包括細(xì)菌、霉菌和酵母。潘見等〔4〕采用VITEK微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對(duì)從草莓上分離到的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明草莓細(xì)菌有8科10屬16種。目前對(duì)莓果上的霉菌研究較少，而實(shí)際上，霉菌引起草莓腐敗變質(zhì)十分常見。李英華等〔10〕從新疆腐爛的草莓中分離到了4種真菌，分別是黑根霉、青霉屬、灰葡萄孢和疫霉屬。魏超等〔11〕從成都產(chǎn)的草莓中分離到4種真菌，鑒定為灰葡萄孢、青霉屬、單囊殼屬和曲霉屬。本研究從草莓果上分離鑒定了9種霉菌，包括青霉屬4種（普通青霉、產(chǎn)黃青霉、奧爾森青霉、小刺青霉）、曲霉屬2種（土曲霉和煙曲霉）、深綠木霉、尖小叢殼菌及擬盤多毛孢。由此可見，不同產(chǎn)地草莓果上的霉菌種類具有一定差異，這可能與氣候、環(huán)境、草莓品種等因素有關(guān)。但不同產(chǎn)地的草莓果上均分離到青霉，因此，青霉是引起草莓果腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)霉菌。

草莓果的貯藏保鮮技術(shù)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用較廣泛的技術(shù)有低溫貯藏、氣調(diào)貯藏、防腐保鮮、涂膜保鮮等〔12-13〕。依據(jù)安全無(wú)毒、經(jīng)濟(jì)可行、易于推廣的原則，本研究分別采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液處理結(jié)合低溫冷藏技術(shù)對(duì)草莓果的防腐效果進(jìn)行探索。結(jié)果表明使用0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低溫冷藏抑菌效果最好。Allais等〔14〕的研究結(jié)果表明，近冰點(diǎn)溫度（例如2℃）貯藏采后的草莓，能顯著降低果實(shí)的生理代謝活動(dòng)，從而極大地抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)草莓的保鮮期。

山梨酸是一種國(guó)際公認(rèn)安全的防腐劑，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）、世界衛(wèi)生組織（WHO）、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）都對(duì)其安全性給予了肯定，其毒性僅為苯甲酸的1∕4、食鹽的1∕2，且對(duì)人體不會(huì)產(chǎn)生致癌和致畸作用〔15〕。山梨酸具有很好的抗菌性，能有效抑制霉菌、酵母菌及其他好氧菌，已廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)產(chǎn)品等行業(yè)。對(duì)于經(jīng)表面處理的鮮水果、鮮蔬菜、醬漬的蔬菜、鹽漬的蔬菜、加工食用菌及藻類，中國(guó)制定的山梨酸的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5 g∕kg（即0.05%），而國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）、FDA和日本則規(guī)定為1.0 g∕kg（即0.1%）。在本研究中，草莓果經(jīng)0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低溫冷藏，可保鮮6 d，具有較好的抑菌效果。本研究為草莓果的保鮮、貯藏及深加工過(guò)程中有目的地控制霉菌提供合理有效的依據(jù)。

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Isolation,Identification and Methods for Inhibiting Growth ofthe Spoilage Molds from Postharvest Strawberry Fruits

Yang Qianran,Gu Xiaoying,Zhang Yunjuan,Wang Wen,Li Lingfei*
（College ofFood Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China）

Objective:The molds from spoilage strawberries were isolated and identified,and the methods for preventing rot were explored to provide a reasonable and effective basis for controlling the molds purposively during the processes ofkeeping fresh,storage and deep processing for strawberries.Methods:The molds isolated from strawberry fruits were identified by morphological characteristics and DNA sequence analysis.Results:The molds causing strawberry rot included Penicillium commune,Penicillium chrysogenum,Penicillium olsonii,Penicillium spinulosum,Aspergillus terreus,Aspergillus fumigates,Trichoderma atroviride,Glomerella acutata and Pestalotiopsis sp..Furthermore,the molds from strawberry fruits were inhibited respectively using ultraviolet,sorbic acid, phytic acid sterilization combining cold storage.It was showed that cold storage after 0.05%sorbic acid was the best preservative method for strawberry fruits.Conclusion:The molds causing strawberry rot were classified 5 genera and 9 species,among which Penicillium was the dominant genus causing strawberry rot.The present results showed that 0.05%sorbic acid solution was an ideal method forfresh keeping and storage ofstrawberries.

strawberry;molds;identification;inhibition

R154

A

2096-2266（2017）06-0059-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.014

（責(zé)任編輯李楊）

云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才資助項(xiàng)目（2011HB027）；云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2016FB030）

2017-01-04

2017-02-09

楊茜然，碩士研究生，主要從事食品微生物研究.

*通信作者：李凌飛，副教授，博士.