皖南花豬鏈球菌分離鑒定及耐藥性研究

呂彩云，王德青，呂 容，孫毅然，范騰飛，王 寧

（黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041）

[資源與環(huán)境]

皖南花豬鏈球菌分離鑒定及耐藥性研究

呂彩云，王德青，呂 容，孫毅然，范騰飛，王 寧

（黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041）

豬鏈球菌病是一類重要的人畜共患傳染病，通過從皖南花豬采集樣本，進(jìn)行豬鏈球菌分離鑒定，對分離菌株經(jīng)過不同藥物抑菌實(shí)驗(yàn)研究，旨在了解地方優(yōu)良品種豬鏈球菌對不同藥物耐藥情況，為地方豬鏈球菌病防治提供參考，為皖南花豬保種及開發(fā)利用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

皖南花豬；分離；鑒定；耐藥性

皖南花豬是國家級重點(diǎn)保護(hù)的 78個地方畜禽品種之一，2001 年 5 月, 被安徽省列入第一批地方畜禽品種保護(hù)名錄。 由于肉味鮮嫩，營養(yǎng)豐富，一直備受 市 場 青 睞[1]。 近 年 來,由 于 受 外 來 高 產(chǎn) 生豬品種的強(qiáng)烈沖擊，皖南花豬等地方品種逐漸被培育品種或雜 交 種所取 代 ，導(dǎo)致皖 南花豬數(shù) 量急劇 下 降[2]。 目前 已 有 專 門 機(jī) 構(gòu) 負(fù) 責(zé) 皖 南 花 豬 保 種 計(jì) 劃[3]。 但 在 實(shí)施保種進(jìn)程中，細(xì)菌性疫病嚴(yán)重危害到皖南花豬生產(chǎn)和繁殖，給保種工作帶來很大麻煩。

豬鏈球菌病屬國家規(guī)定的二類動物疫病，是一類重要的人畜共患傳染病。 1968 年丹麥學(xué)者首次報道了3例人感染豬鏈球菌導(dǎo)致腦膜炎并發(fā)敗血癥病例，截至 2000 年，全球已報道了 200 多例人感染豬鏈球菌病病例，報道病例較多的國家或地區(qū)普遍養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)或有食用豬肉的習(xí)慣，病例呈高度散發(fā)態(tài)勢[4]。 在我國 ，1998 年江 蘇省 報 告了人 感染豬鏈 球菌病，發(fā)病 25 例，死亡 14 例；2005 年 6-8 月，四川省發(fā)生的人感染豬鏈球菌病爆發(fā)疫情，為國內(nèi)外迄今為止見于報道的最大規(guī)模人感染豬鏈球菌病疫情，發(fā) 病數(shù) 204 例，死亡 38 例[5]。 在 豬鏈球 菌疫 病 防治過程中，抗生素成為首選藥物，由于抗生素大量使用，導(dǎo)致豬鏈球菌耐藥性日益嚴(yán)重，并呈現(xiàn)一定的區(qū)域特征。

為了解皖南花豬鏈球菌的感染情況及耐藥現(xiàn)象，本研究從皖南地區(qū)皖南花豬規(guī)?；B(yǎng)殖場采集 50個臨床樣本，進(jìn)行豬鏈球菌分離鑒定，通過對分離到的豬鏈球菌菌株進(jìn)行不同藥物抑菌實(shí)驗(yàn)研究，旨在系統(tǒng)了解皖南花豬鏈球菌對不同藥物耐藥情況，為皖南花豬保種場及養(yǎng)殖戶能及時、準(zhǔn)確、有針對性地選用藥物，制定科學(xué)、系統(tǒng)的防治方案提供科學(xué)依據(jù)，為皖南花豬保種及開發(fā)利用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2015 年 7 月份，在無菌條件下，從皖南地區(qū)某皖南花豬養(yǎng)殖場采集健康豬群的生長豬、商品豬、母豬、公豬 4 個不同生長階段豬的鼻拭子，共 50 份樣品。 見表1。

表1 采集份數(shù)

1.1.2 儀器與試劑

顯微鏡、離心機(jī)、培養(yǎng)箱、-80℃冰箱、無菌操作臺等儀器，牛肉粉、胰蛋白胨、葡萄糖、碳?xì)渌徕c、氯化鈉、磷酸氫二鈉、革蘭氏染色液配置試劑等均由黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。多粘菌素 B、無菌綿羊血、各類抗生素藥敏紙片均購自上海古朵生物科技有限公司，購買的藥敏紙片分別有：β內(nèi)酰胺類的阿莫西林、頭孢菌素；氨基糖胺類的慶大霉素、卡那霉素；四環(huán)素類的金霉素、土環(huán)素；氯霉素類的氯霉素、氟苯尼考；大環(huán)內(nèi)酯類的羅紅霉素、紅霉素；喹諾酮類的環(huán)丙沙星、諾氟沙星；呋喃類藥物有呋喃妥因、呋喃唑酮。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配置

THB 增菌培養(yǎng)液配置（g/L）：牛肉粉 10.0g，胰蛋白胨 20.0g， 葡 萄 糖 2.0g， 碳 酸氫 鈉 2.0g， 氯化鈉2.0g，磷酸氫二鈉 0.4g，pH 值調(diào)至 7.8±0.1，溫度控制在 25℃。 向其液體培養(yǎng)基中加入 5%無菌綿羊血和0.2%多粘菌素 B，搖勻，分裝。

選擇性血平板制備： 以 THB 液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ), 向其中加入 15%的瓊脂，高壓蒸汽滅菌 121℃，滅菌 30min，冷卻到 55℃左右，向其加入 5%的無菌綿羊血清和 15μg/mL 多粘菌素 B，充分混勻， 倒平板，使其冷卻，待用。

1.2.2 病原分離培養(yǎng)

將采集樣品首先接種于滅菌的 5mL THB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行豬鏈球菌增菌培養(yǎng)，37℃培養(yǎng) 12h 后，分別取 200uL 增菌液劃線接種于滅菌的選擇性血平板，37℃培養(yǎng) 24h 后，挑取表面呈灰白色、光滑、針尖大小的圓形菌落接種于鮮血瓊脂平板純培養(yǎng)。

1.2.3 鏡檢

挑取可疑的菌落分別進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，染色過程為結(jié)晶紫浸染 1-2min，碘液媒染 2min，酒精脫色 30s，石炭酸番紅復(fù)染 30s，最后鏡檢觀察。

1.2.4 生化鑒定

將經(jīng)過分離純化的疑似菌落利用蔗糖、葡萄糖等糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以及硫化氫等生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

對鑒定為陽性的分離純化菌分別采用 K-B 紙片 擴(kuò) 散 法[4]進(jìn) 行 藥 敏 試 驗(yàn) ， 首 先 挑 取 單 個 菌 落 均 勻密集的涂布在整個平板上，將含有不同藥物的藥敏紙片用燒灼滅菌的鑷子分別貼于平板表面，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。同時設(shè)置對照，每個藥敏紙片相距 24mm,且與邊緣距離不小于 14mm， 蓋上平板封口， 恒溫箱37℃，18h 培養(yǎng)，測定抑菌圈大小。

2 結(jié) 果

2.1 病原分離純化鑒定結(jié)果

將從皖南地區(qū)養(yǎng)殖場采集到的 50份皖南花豬鼻拭子樣品，分別經(jīng)過 THB 液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，選擇性血平板分離純化培養(yǎng)，挑取菌落形態(tài)呈飽滿圓潤、表面光滑濕潤、邊緣整齊、半透明的疑似菌落。 經(jīng)革蘭氏染色呈藍(lán)色，單個，或呈少量的 3-5 個排列的短鏈球菌。 最后將經(jīng)葡萄糖、蔗糖等生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定符合豬鏈球菌生化培養(yǎng)特性，鑒定為豬鏈球菌，鏡檢結(jié)果見圖 1。 結(jié)果分離到 14 株豬鏈球菌，分離率達(dá)到 28%。

圖1 豬鏈球菌株革蘭氏染色鏡檢

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將分離鑒定的 14株豬鏈球菌分別進(jìn)行 β 內(nèi)酰胺類等 7 類 12 種藥物的藥敏試驗(yàn)，同時設(shè)置對照，藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 豬鏈球菌分離株的藥敏試驗(yàn)表

3 討 論

皖南花豬是我國地方優(yōu)良種豬之一，隨著外來種豬的影響，現(xiàn)有種群數(shù)量少，優(yōu)良基因流失。 許多疫病嚴(yán)重影響到地方品種豬的生產(chǎn)性能，如豬鏈球菌病，它是一種人畜共患的急性、熱性傳染病，臨床可能導(dǎo)致哺乳仔豬下痢和孕豬流產(chǎn)等癥狀，嚴(yán)重可致生豬死亡，因此，做好豬鏈球菌病的防治工作對皖南花豬保種工作具有非常重要的意義。

本研究在分離豬鏈球菌時，考慮到樣本是在大外環(huán)境下從豬鼻腔分泌液中采集，樣本中的細(xì)菌種類和數(shù)量較多，按照常規(guī)的培養(yǎng)分離方法純化到所需要的細(xì)菌較難， 根據(jù)羅隆澤等人 2007 年文獻(xiàn)報道[6]，多 黏 菌素 B 對豬 鏈 球 菌 沒 有 任 何 抑 制 作 用 ，而對大腸桿菌、綠膿桿菌等常見標(biāo)本菌具有很好的抑制效果。 因此，本實(shí)驗(yàn)選用多黏菌素 B制備的選擇性血平板培養(yǎng)基通過平板劃線方法排除樣本中的革蘭氏陰性菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察進(jìn)一步分離純化，再結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定符合要求的豬鏈球菌。 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，整個分離純化效果比較理想，50 份豬鼻拭子分離到 14 株豬鏈球菌， 分離率達(dá)到28%。

為了較全面系統(tǒng)的了解對皖南花豬鏈球菌敏感的藥物， 本研究選用 β內(nèi)酰胺類的阿莫西林、頭孢菌素，氨基糖胺類的慶大霉素、卡那霉素等 7 大類 14 種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從試驗(yàn)結(jié)果看，從皖南花豬分離到的豬鏈球菌對 β-內(nèi)酰胺類抗生素高度敏感；氯霉素類抗生素、氨基糖苷類抗生素以及呋喃類抗生素較為敏感；喹諾酮類藥物、四環(huán)素類抗生素及大環(huán)類酯類抗生素不敏感，有較明顯的耐藥現(xiàn)象。 因此，在豬鏈球菌病的防治過程中，建議不定期進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)合藥敏結(jié)果，科學(xué)指導(dǎo)用藥；在飼養(yǎng)管理過程中，盡量避免長期使用同一種藥物，也可以用不同藥物交替使用或幾種藥物聯(lián)合使用，對減少豬鏈球菌病的發(fā)病率和死亡率以及皖南花豬的保種工作非常有利。

皖南花豬鏈球菌病防治堅(jiān)持以預(yù)防為主，不管是規(guī)?；谋７N場，還是農(nóng)村的散養(yǎng)戶，都要注意搞好衛(wèi)生，管理好飼料，保證豬群的營養(yǎng)，保持良好的通風(fēng)和適宜的溫度、濕度；要定期消毒，交替使用消毒藥；控制人員和物品的流動，同時做好其他疫病的防治工作。

[1]李小金，錢坤，劉林清，等.皖南花豬與大約克豬胴體及肉質(zhì)性狀比較研究[J].養(yǎng)豬，2015（6）：77-80.

[2]王德青，唐鑫生，黃松，等.皖南花豬種質(zhì)資源保護(hù)現(xiàn)狀與開發(fā)利用對策[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013，（11）：294-297.

[3]洪云華.皖南花 豬資源現(xiàn)狀 及存在問題 與 對 策[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2010，16（9）：191-193.

[4]Yu H，Jing H，Chen Z，etal.Human Streptococcus suis out-break,Sichuan，China[J].Emerg Infect Dis，2006,12（6）：914-920.

[5]Hui AC，Ng KC，Tong P Y，et al.Becterial meningitis in HongKong：10-years’experience[J].Clin Neurol Neurosurg，2005，107（5）：366-370.

[6]羅隆澤，李燕春，郭宗 琪 ，等.豬鏈球菌 選 擇性培養(yǎng) 基 研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，2007，23（5）：511-514.

責(zé)任編輯：胡德明

The Isolation,Identification and Drug Resistances of Streptococcus suis from the Pig in Southern Anhui

Lv Caiyun,Wang Deqing,Lv Rong,Sun Yiran,Fan Tengfei,Wang Ning
（School of Life and Environmental Sciences,Huangshan University,Huangshan 245041,China）

Streptococcus suis is a common infectious disease in human and swine.This experiment, taking samples from pigs in Southern Anhui,isolates and identifies the pathogenic bacteria,and then conducts drug sensitive experiments on the bacteria in order to understand the drug resistance of streptococcus against different antibiotics.This experiment provides reference for the prevention and control of Streptococcus suis,and lays a solid foundation for the conservation and utilization of the pig in Southern Anhui.

the pig in Southern Anhui;isolation;identification;drug resistance

S828.8

：A

：1672-447X（2017）03-0050-03

2016-12-27

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJHS2017B15）；黃山市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（2015Z-01）

呂彩云（1978-），甘肅天水人，碩士，黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院教師，研究方向?yàn)閯游锊≡肿蛹拔⑸飳W(xué)。