GST-CBX2-1融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在原核細(xì)胞中的表達(dá)①

劉婷雋，洪澤輝，胡安康

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 徐州 221004;2.東南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

GST-CBX2-1融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在原核細(xì)胞中的表達(dá)①

劉婷雋1，洪澤輝2，胡安康1

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 徐州 221004;2.東南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

目的：構(gòu)建GST標(biāo)簽的CBX2-1融合蛋白表達(dá)載體，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，純化出表達(dá)蛋白。方法：以CBX2-1全長(zhǎng)為模板，構(gòu)建3對(duì)引物，將CBX2-1PCR擴(kuò)增成3段，通過(guò)XhoⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)將其定向插入pGEX-4T-3載體中，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5ɑ，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切電泳和DNA測(cè)序堅(jiān)定正確后，轉(zhuǎn)入E.coliBL21中，經(jīng)IPTG大量誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳和Westernblot鑒定，運(yùn)用GSTpulldown方法純化3段蛋白。結(jié)果：酶切電泳及測(cè)序結(jié)果證明，原核表達(dá)質(zhì)粒GST-CBX2-1 3個(gè)載體構(gòu)建成功，用Westernblot方法證實(shí)了GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的表達(dá)，并成功純化出3段蛋白。結(jié)論：成功構(gòu)建了GST-CBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3原核表達(dá)載體，證實(shí)了其在原核細(xì)胞大腸埃希菌中的表達(dá)與純化，為進(jìn)一步研究CBX2-1各結(jié)構(gòu)域的功能提供了前提基礎(chǔ)。

CBX2-1蛋白；原核表達(dá)；載體構(gòu)建；蛋白純化

多梳家族(PcG)蛋白可以作為組蛋白修飾激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)參與基因表達(dá)的調(diào)控[1]。研究表明，PcG成員參與不同的細(xì)胞過(guò)程，例如干細(xì)胞分化、細(xì)胞命運(yùn)決定、衰老、哺乳動(dòng)物或腫瘤形成過(guò)程中調(diào)節(jié)X染色體的失活[2～4]。CBX2，是Pc家族同系物，N端含有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，C端含有高度保守的Pc盒[5，6]。在人類CBX2基因座上，含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄體，一個(gè)轉(zhuǎn)錄體是由5個(gè)外顯子組成含有532個(gè)基因的亞體CBX2-1，其包含保守的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域和Pc盒。另一個(gè)轉(zhuǎn)錄體CBX2-2由4個(gè)外顯子組成包含211個(gè)基因，其只存在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，沒(méi)有Pc盒[7]。前人的研究發(fā)現(xiàn),CBX2-1比CBX2-2表達(dá)量更高，對(duì)CBX2-1的探究更深入，于是本實(shí)驗(yàn)選取CBX2-1作為研究對(duì)象。為深入研究CBX2-1各結(jié)構(gòu)域的功能及分子機(jī)制，我們利用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了CBX2-1-1、CBX2-1-2、CBX2-1-3基因原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)其融合蛋白，GSTpulldown成功純化3段蛋白，為CBX2-1各結(jié)構(gòu)域功能的研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

CBX2-1模版由東南大學(xué)洪澤輝老師實(shí)驗(yàn)室提供；引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；RedTaqDNA聚合酶、10mmol/LdNTPs、10×PCRBuffer(Mg2+free) 、25mmol/LMgCl2、無(wú)菌雙蒸水ddH2O、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、TAE電泳緩沖液、SDS凝膠上樣緩沖液、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移緩沖液、Tris-Glycine電泳緩沖液。

1.1.2 引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)3對(duì)引物送南京金斯瑞公司合成，見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增目的基因的引物序列

F-1、F-259、F-601的5’端添加X(jué)hoⅠ酶切位點(diǎn)，R-288、R-600、R-1596的3’端添加NotⅠ酶切位點(diǎn)。

1.1.3 主要試劑盒

TaKaRaDNABluntingKit(DNA平滑化連接試劑盒)、TaKaRaTaqTM酶、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0(質(zhì)粒提取試劑盒)和TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0(瓊脂糖膠回收提純DNA試劑盒)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;RestrictionEndonuclease(限制性內(nèi)切酶)與T4DNALigase(T4DNA連接酶)購(gòu)自NEB(北京)生物科技有限公司、GSTResin購(gòu)于南京金斯瑞公司、兔抗鼠二抗(HRP標(biāo)記)購(gòu)于上海Genetech公司、ECLplus購(gòu)于美國(guó)GE公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

MJPCR擴(kuò)增儀、Eppendorf移液槍、Eeppendorf超速冷凍離心機(jī)、DYY-8C型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫干燥箱、低溫冰箱、超低溫冰箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、SP-2102UV型微量紫外分光光度計(jì)、LQP-B-4顆粒測(cè)定儀(制冰機(jī)),超聲機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增CBX2-13段基因，將pGEX-4T-3載體和CBX2-1 3段PCR產(chǎn)物分別用NotⅠ和XhoⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶雙酶切，并進(jìn)一步純化，T4DNA連接酶16℃連接4h，然后涂到含有氨芐抗性的培養(yǎng)板上，37℃過(guò)夜，挑取白色克隆，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃、250rpm過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒后酶切及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 重組蛋白在原核細(xì)胞中的大量表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-CBX2-1及pGEX-4T-3空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜的培養(yǎng)液以1:50轉(zhuǎn)接于含100mL新鮮培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)1.5～2h，使OD值達(dá)0.4～0.6。加入IPTG(終濃度為0.5mM，37℃、250rpm條件下培養(yǎng)8h。

1.2.3GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的純化

誘導(dǎo)后的細(xì)菌在4℃、5000rpm條件下離心15min，用冰PBS洗一次，離心去上清。取沉淀菌體，向沉淀中加入8mLPBS和終濃度為1mM的PMSF，超聲破碎大腸桿菌細(xì)胞，超聲條件為：超10s，停10s，40%功率，15min。整個(gè)超聲過(guò)程需在冰上進(jìn)行，以防超聲過(guò)程中蛋白質(zhì)預(yù)熱變性。

超聲后，12000rpm，離心15min取上清，分別與GlutathioneResinbeads孵育，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，次日，3000rpm，5min，離心收集珠子。用含有500mMNacl，1%TritonX-100的PBS洗滌珠子，4℃旋轉(zhuǎn)5min，共5次。離心收集珠子，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化結(jié)果。

1.2.4 Western Blot

將純化好的珠子，加入適量SDS loading buffer裂解，100℃、煮沸5min。12000rpm、離心15min，取上清。等量的蛋白通過(guò)12%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行跑膠分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用2%脫脂奶粉封閉1h，并分別用GST(1:2000)、p53(1:1000)、抗體孵育，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠(1:2000)二抗，室溫孵育2h，TBST洗膜；ECL顯色、發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)擴(kuò)增3段CBX2-1基因

在本實(shí)驗(yàn)中，我們將其分為1-288,259-600,601-1596三段，分別對(duì)CBX2-1所分的3段基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可見(jiàn)約288bp、342bp、997bp的特異性片段與預(yù)期相符，見(jiàn)圖1。

2.2 GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切后得到相應(yīng)大小的條帶，見(jiàn)圖2，與預(yù)期一致，進(jìn)一步測(cè)序鑒定正確。

圖1 CBX2-1的3段目的基因PCR產(chǎn)物電泳圖

M DNA標(biāo)志物；1、2、3分別為CBX2-1 3段目的基因的PCR產(chǎn)物

圖2 GST-CBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切結(jié)果電泳圖

2.3 GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596) 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)

將3個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，在0.5mmol/L IPTG、30℃下，誘導(dǎo)表達(dá)3h，考馬斯亮藍(lán)染色后在40kDa、42kDa、68kDa附近出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其分子量與預(yù)期相符，見(jiàn)圖3。

圖3 考馬斯亮藍(lán)染色鑒定GST-CBX2-13段蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3 融合蛋白的純化及鑒定

運(yùn)用GST pull down實(shí)驗(yàn)原理，對(duì)CBX2-1的3段基因表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色后在40 kDa、42 kDa、68 kDa附近出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其分子量與預(yù)期相符，見(jiàn)圖4。

2.5 Western Blot檢測(cè)CBX2-1的3段蛋白的純化結(jié)果

Western Blot進(jìn)一步鑒定GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3的表達(dá)，結(jié)果可見(jiàn)在40 kDa、42 kDa、68 kDa附近出現(xiàn)明顯的特異性條帶，見(jiàn)圖5，說(shuō)明成功表達(dá)出3段重組融合蛋白。

圖4 考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)GST pull down純化CBX2-1 3段蛋白

圖5 Western Blot檢測(cè)CBX2-1的3段蛋白的純化

3 討論

CBX2參與人類性成熟過(guò)程，它和鼠中同源蛋白M33都是PcG家族成員。研究發(fā)現(xiàn)[8]，與其他的前列腺癌相比，在神經(jīng)性前列腺癌中CBX2作為作重要的表觀遺傳學(xué)上調(diào)因子。CBX2的高表達(dá)與患者的預(yù)后結(jié)果差及更嚴(yán)重的腫瘤表型密切相關(guān)，并符合神經(jīng)性前列腺癌的臨床特征。人類CBX2存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，CBX2-1含有532個(gè)基因，CBX2-2含有211個(gè)基因。為了深入研究CBX2-1各結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能，構(gòu)建CBX2-1的原核表達(dá)載體是關(guān)鍵之一。在本研究中，我們根據(jù)CBX2-1的空間結(jié)構(gòu)將CBX2-1分成3段，成功構(gòu)建GBX2-1-1

(1-288)，CBX2-1-2(259-600)，CBX2-1-3(601-1596)的原核表達(dá)載體，并利用IPTG進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，獲得GST-GBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3純化蛋白。在載體選擇上，我們采用了pGEX-4T-3載體，此類載體帶有GST標(biāo)簽，能夠增加目的蛋白的溶解度，融合蛋白可以很方便地從細(xì)菌細(xì)胞裂解液中用Glutathione Sepharose等柱料吸附純化。pGEX載體帶有一個(gè)tac啟動(dòng)子，可作誘導(dǎo)表達(dá)用，適用于任何大腸桿菌，并且可以用溫和的洗脫條件從親和介質(zhì)上洗脫下來(lái)，最大限度地減少對(duì)抗原性的活性損傷。

本研究為進(jìn)一步了解CBX2-1蛋白各結(jié)構(gòu)域的功能提供了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步探索CBX2-1相互作用的蛋白及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供了新思路。

[1]Simon JA and RE Kingston. Occupying chromatin: Polycomb mechanisms for getting to genomic targets, stopping transcriptional traffic, and staying put[J]. Mol Cell,2013，49(5):808-824

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江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，編號(hào)：13KJD180003。

劉婷雋(1990～)女，江蘇徐州人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師。

胡安康(1981～)男，江蘇徐州人，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。E-mail：5501908@qq.com。

Q

A

1008-0104(2017)03-0118-03

2017-03-16)