大鼠脊髓不同程度損傷后早期血清中NSE和S-100β的表達(dá)①

王崇禧，周成福，蘇 航，張?jiān)鲈?/p>

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

大鼠脊髓不同程度損傷后早期血清中NSE和S-100β的表達(dá)①

王崇禧，周成福，蘇 航，張?jiān)鲈?/p>

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探索大鼠正常及不同程度脊髓損傷(SpinalCordInjury，SCI)后血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和星形膠質(zhì)源性蛋白(S-100β)的表達(dá)及規(guī)律。方法：取54只SD大鼠，隨機(jī)分成A、B、C、D、E、F6組。前4組選取改良Allen’s法建造不同程度SCI樣本，至傷能量經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選擇如下：A組(2.5cm×10g)、B組(4.5cm×10g)、C組(6.5cm×10g)、D組(8.5cm×10g)E組僅顯露脊髓，不致傷，F(xiàn)組正常觀察。打擊后大鼠發(fā)生擺尾，雙下肢及機(jī)體回縮，進(jìn)而雙下肢自然松弛術(shù)，表明打擊確實(shí)，后行改良體感誘發(fā)電位(somatosensoryevokedpotential,SEP)檢測(cè)，評(píng)估脊髓損傷程度的可信性，去除不合格模型。術(shù)后3h、6h、12h、48h、72h時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量分析各組大鼠血清中NSE和S-100β變化。術(shù)后7d時(shí)行改良SEP評(píng)估神經(jīng)功能損傷與恢復(fù)情況。結(jié)果：①在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。②一定損傷程度范圍內(nèi)，ABCD四組模型相同時(shí)間點(diǎn)血清中NSE和S-100β定量分析較正常增多，損傷各組間檢測(cè)結(jié)果比較有差別(P<0.05)，脊髓損傷程度越重，血清中NSE和S-100β兩者陽性表達(dá)結(jié)果增加，脊髓損傷后6h，二者陽性表達(dá)達(dá)到最大值，呈正相關(guān)關(guān)系。③通過本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，大鼠在輕度致傷后血清中NSE含量表達(dá)平均值達(dá)到6.26ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常大鼠組。NSE和S-100β在本文的研究中發(fā)現(xiàn)不具有相關(guān)性。結(jié)論：①在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。②一定損傷程度范圍內(nèi)，隨著損傷程度的增進(jìn)，大鼠血清中NSE和S-100β表達(dá)有所升高，且與脊髓損傷的程度呈正相關(guān)，即：隨著程度的不斷加大，NSE和S-100β的陽性表達(dá)結(jié)果逐漸增多；大鼠脊髓損傷后6h的陽性表達(dá)量到達(dá)最大值，明顯高于對(duì)照組。因此可以認(rèn)為一定程度上NSE和S-100β檢測(cè)可以作為評(píng)判、估計(jì)脊髓損傷程度的一種方法。③從本文數(shù)據(jù)分析，我們可以認(rèn)為當(dāng)大鼠血清中NSE含量大于6.26ng/mL時(shí)可能出現(xiàn)了脊髓的損傷，這有一定意義存在。NSE和S-100β兩者在研究中發(fā)現(xiàn)不具有相關(guān)性，這還需要我們進(jìn)一步的探索。椎板切除術(shù)操作不會(huì)明顯影響大鼠血清中NSE和S-100β的定量分析以及改良SEP的檢測(cè)。

脊髓損傷；NSE；S-100β；血清；大鼠

SCI發(fā)病較為常見，常引起損傷平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)、反射、植物神經(jīng)功能紊亂，大小便失禁及性功能障礙，嚴(yán)重影響了病患及其家庭。烯醇化酶同工酶中的αγ及γγ型獨(dú)特地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，所以叫作神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。NSE絕大部分在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的灰質(zhì)內(nèi)，損傷的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，得以釋放的NSE可通過血-脊髓屏障而進(jìn)入外周血。S-100β可體現(xiàn)、揭示膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，是白質(zhì)異常的標(biāo)記[1]。損傷等因素活化膠質(zhì)細(xì)胞而過度表達(dá)S-100β，使星形膠質(zhì)細(xì)胞等形成致炎性因子以及一氧化氮，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞功能障礙甚至死亡[2～5]。本研究采取ELISA試驗(yàn)定量分析血清中的NSE和S-100β，以期為精確判斷、評(píng)估不同程度SCI提供一種新手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

取健康SD大鼠54只，體重(220±10)g。隨機(jī)分成A～F共6組大鼠，每組9只。

1.2 制作模型和相關(guān)檢測(cè)

采取Allen's法建造不同程度SCI的大鼠模型。3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)，麻醉(腹腔注射)成功后固定體位，去毛、消毒、鋪大小適宜無菌巾。取T10棘突為中心作后正中切口，嚴(yán)格參照手術(shù)入路規(guī)范及解剖特點(diǎn)，顯露出T10棘突后，仔細(xì)咬除T9～T11棘突及全部椎板，合理、適度顯露椎管及硬脊膜。于T10段脊髓上安放墊片，取打擊圓柱從不同高度處釋放。至傷能量經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選擇如下：A組(2.5cm×10g)、B組(4.5cm×10g)、C組(6.5cm×10g)、D組(8.5cm×10g)，標(biāo)記發(fā)生擺尾，雙下肢及機(jī)體回縮，進(jìn)而雙下肢自然松弛的大鼠，說明建造模型打擊確實(shí)[6,7]。術(shù)后立即進(jìn)行改良SEP檢測(cè)，綜合評(píng)斷脊髓損傷程度的可信性，剔除不合格模型并予以補(bǔ)充。E組僅顯露脊髓，余操作與實(shí)驗(yàn)組一致，以青霉素溶液沖洗術(shù)區(qū)后逐層縫合組織，F(xiàn)組正常觀察。術(shù)后注射抗生素，大鼠室溫下自由喂養(yǎng)，大鼠8h排尿一次，定時(shí)取血檢樣。

1.3 改良體感誘發(fā)電位(SEP)

麻醉滿意后穩(wěn)固鼠頭，消毒，取頂正中切口，依次切開組織后以紗布擦去骨膜，使顱骨顯露面大小適宜。在矢狀縫左側(cè)冠狀縫后緣處，以牙科鉆鉆孔，孔無需打穿，保留薄層骨質(zhì)，避免損傷顱腦。記錄并保存SEP波形疊加、平均處理后的數(shù)據(jù)。及時(shí)觀察術(shù)后及術(shù)后7d時(shí)大鼠SEP變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓不同程度損傷后NSE和S-100β定量分析：大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。一定損傷程度范圍內(nèi)，ABCD四組模型相同時(shí)間點(diǎn)血清中NSE和S-100β定量分析較正常增多，損傷各組間檢測(cè)結(jié)果比較有差別(P<0.05)，脊髓損傷程度越重，血清中NSE和S-100β含量增多,改良SEP恢復(fù)情況及后期癥狀改善越差(P<0.05)。大鼠不同程度脊髓損傷NSE和S-100β定量分析結(jié)果見表1～2，圖1～2。

圖1 NSE檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

組別ABCDEF3h6.26±1.148.20±1.1410.10±1.8316.03±1.351.74±0.351.27±0.396h10.67±1.4114.00±1.2717.46±2.3819.86±1.931.69±0.381.69±0.1912h9.19±1.6611.88±0.9515.14±1.8317.69±1.401.56±0.391.55±0.5348h8.85±1.2410.87±1.1915.31±0.9916.77±1.011.65±0.271.61±0.30

圖2 S-100β檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

組別ABCDEF3h0.26±0.020.31±0.040.35±0.030.39±0.050.08±0.0050.08±0.0066h0.36±0.030.62±0.030.76±0.050.87±0.050.08±0.0060.08±0.00412h0.30±0.020.52±0.070.59±0.050.71±0.050.08±0.0070.07±0.00648h0.31±0.020.51±0.080.59±0.020.67±0.020.08±0.0070.08±0.004

2.2 一定損傷程度范圍內(nèi)，大鼠模型脊髓損傷越重，改良SEP恢復(fù)情況及后期癥狀改善越差(P<0.05)。見表3～4。

表3 各組不同時(shí)間SEP潛伏期,單位：ms)

表4 各組不同時(shí)間SEP波幅，單位：μv)

2.3 研究NSE和S-100β相關(guān)性的研究(pearson相關(guān)性=0.022，單位：ng/mL)，見圖3。

圖3 血清中NSE和S-100β的散點(diǎn)圖

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩者之間沒有相關(guān)性，結(jié)果可能受樣本數(shù)據(jù)及操作手法、試劑盒敏感程度的影響，我們還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證與考量。

3 討論

SCI常引起損傷平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)、反射減弱或消失，植物神經(jīng)功能紊亂，大小便失禁及性功能障礙，造成患者嚴(yán)重病廢。患者有時(shí)影像學(xué)檢查上表現(xiàn)輕，脊髓外觀上保持完整并且連貫，但卻出現(xiàn)喪失大部分或者全部脊髓功能的癥狀，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重后遺癥?，F(xiàn)階段，對(duì)病人進(jìn)行正確的神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查，參考影像學(xué)等輔助檢查，可以診斷出脊髓是否受損。但是在早期判斷其損傷的程度仍有一定困難，其手術(shù)適應(yīng)征在選擇上尚不非常明確和嚴(yán)謹(jǐn)，葉春平通過研究后認(rèn)為，在無骨折脫位型頸髓損傷中，JOA評(píng)分輕、中度患者可不必早期進(jìn)行手術(shù)治療。洪毅等倡導(dǎo)進(jìn)行手術(shù)治療，觀點(diǎn)是通過手術(shù)才能夠?qū)h(yuǎn)期脊髓功能的恢復(fù)情況有積極的影響。由此可見手術(shù)與否的選擇爭(zhēng)議很大。當(dāng)前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，短期內(nèi)神經(jīng)功能無明顯恢復(fù)或恢復(fù)不滿意者可有手術(shù)指征。手術(shù)與否及手術(shù)時(shí)間的掌握常常困擾著醫(yī)療工作人員，對(duì)病情發(fā)展的準(zhǔn)確評(píng)估仍是一個(gè)較大的難題。所以最好出現(xiàn)一個(gè)指標(biāo)用來協(xié)助我們準(zhǔn)確地辨別脊髓損傷程度、恢復(fù)狀況和依據(jù)具體損傷來決定診療方案，避免病情進(jìn)一步發(fā)展或惡化。

在分辨脊髓損傷程度方面，改良SEP檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯。其潛伏期的存在及時(shí)間長短可判定被測(cè)試感覺纖維的傳導(dǎo)功能，傳導(dǎo)功能異?？墒?jié)摲跁r(shí)間延長。其波幅的大小則代表了受測(cè)神經(jīng)纖維產(chǎn)生同步放電神經(jīng)元的量的多少。本實(shí)驗(yàn)為判定脊髓損傷程度的可信度和脊髓損傷的恢復(fù)情況，采用改良SEP檢測(cè)方法。正常血液中NSE含量極微，約3～8ng/mL[8]。NSE與乳酸脫氫酶、醛縮酶、肌酸激酶不同，它不與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白結(jié)合，因而很容易釋放出來。國內(nèi)秦凱[9]在大鼠急性SCI后通過對(duì)血漿中NSE的定量分析發(fā)現(xiàn)其會(huì)明顯增高，能夠客觀的監(jiān)測(cè)脊髓損傷嚴(yán)重情況。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，S-100β

參與神經(jīng)元損傷病理機(jī)制和重塑機(jī)制，可體現(xiàn)、反映神經(jīng)元的完整性。在形態(tài)方面因?yàn)镾-100β分子量小，容易通過屏障，可較易測(cè)得。在模型成功后探討用臨床上容易獲取的血清，通過對(duì)其中NSE及S-100β的測(cè)定來揭示大鼠脊髓損傷情況及恢復(fù)程度。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β；一定損傷程度范圍內(nèi)，隨著損傷程度的增進(jìn)，大鼠血清中NSE和S-100β表達(dá)有所升高，且與脊髓損傷的程度呈正相關(guān)，即：隨著程度的不斷加大，NSE和S-100β的陽性表達(dá)結(jié)果逐漸增多；大鼠脊髓損傷后6h的陽性表達(dá)量到達(dá)最大值，明顯高于對(duì)照組?？烧J(rèn)為NSE和s-100β能夠作為檢測(cè)脊髓損傷嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)，進(jìn)一步為臨床研究方向提供一種新見解。 從本文數(shù)據(jù)分析，我們可以認(rèn)為當(dāng)大鼠血清中NSE含量大于6.26ng/mL時(shí)可能出現(xiàn)了脊髓的損傷，這有一定意義存在。NSE和S-100β兩者在研究中發(fā)現(xiàn)不具有相關(guān)性，這還需要我們進(jìn)一步的探索。

本文實(shí)驗(yàn)亦存在不足之處，樣本數(shù)量不夠龐大，實(shí)驗(yàn)手法及技巧仍需要加強(qiáng)，同時(shí)，鑒于資金等局限因素，未能進(jìn)行大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)在統(tǒng)計(jì)72h組時(shí)因樣本丟失過大，統(tǒng)計(jì)可信性降低，未予以采用，因而還需要以后進(jìn)行更具代表性的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[1]LoyDN,SroufeAE,PeltJL,etal.Serumbiomarkersforexperimentalacutespinalcordinjury:rapidelevationofneuron-specificenolaseandS-100beta[J].Neurosurgy,2005,56(2):391-397

[2]鄧曉冬,李躍輝,鐘曉.脊柱爆裂性骨折伴脊髓損傷患者圍術(shù)期血清炎性與神經(jīng)功能指標(biāo)的變化[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,20(5):670-672,676

[3]YokoboriS,ZhangZ,MoghiebA,etal.Acutediagnosticbio-markersforspinalcordinjury:reviewoftheliteratureandpreliminaryresearchreport[J].WorldNeurosurg,2015,83(5):867-878

[4]KonstantinouEA,VenetsanouK,MitsosAP,etal.NeuronspecificenolaseNSE:avaluableprognosticfactorofcentralnervoussystemdysfunctionfollowingcardiacsurgery[J].BritJAnaesthetRecNur,2008,19:22-28

[5]UndenJ,IngebrigtsenT,RomnerB.Managementofminorheadinjurieswiththehelpofabloodtest.S100-βanalysiscanreducethenumberofCTexaminationsandpatientadmissions[J].Lakartidningen,2008,105(2425):1846-1848

[6]王勇,周成福,鮑靖,等.大鼠急性脊髓損傷時(shí)NSE的表達(dá)及臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2012,35(4):47-48

[7]宿獻(xiàn)偉,周成福,馬曉茹.大鼠急性脊髓損傷早期Rab3a的表達(dá)[J].黑龍江醫(yī)藥學(xué),2012,35(4):38-39

[8]O'BrienMD.Spinalcordinjury:progress,promiseandpriorities[J].JournaloftheRoyalSocietyofMedicine, 2006, 99(11):585-586

[9]秦凱,周成福,李亞峰.急性脊髓損傷時(shí)NSE和ET的表達(dá)及臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(6):11-12

1.2016年佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目,編號(hào)：YM2016_026；2.黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：12531717。

王崇禧(1987～)男,山東沂水人,在讀碩士研究生。

周成福(1964～)男，黑龍江佳木斯人,碩士，主任醫(yī)師,教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:3534478470@qq.com。

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1008-0104(2017)03-0047-03

2016-11-30)