細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白對(duì)體外細(xì)胞生物學(xué)行為的影響①

李善昌，董 波，曲學(xué)延，閆 磊，寧尚波，劉占領(lǐng)

(佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳術(shù)斯 154002)

細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白對(duì)體外細(xì)胞生物學(xué)行為的影響①

李善昌，董 波，曲學(xué)延，閆 磊，寧尚波，劉占領(lǐng)

(佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳術(shù)斯 154002)

目的：探討細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白對(duì)體外細(xì)胞生物學(xué)行為的增殖影響及基因表達(dá)。方法:構(gòu)建含細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白基因的質(zhì)粒后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，利用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株hMEPE蛋白表達(dá)結(jié)果?；诘鞍妆磉_(dá)結(jié)果基礎(chǔ)上通過RT-PCR檢測p53基因的表達(dá)水平，MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖水平。結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比p53基因在轉(zhuǎn)染目的基因細(xì)胞表達(dá)增高。MTT結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),顯示轉(zhuǎn)染后的hmepe細(xì)胞株較轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比增殖能力明顯提高。結(jié)論：細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋可以通過p53信號(hào)通路提高細(xì)胞增殖能力。

細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白;增殖

細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(matrixextracellularphosphoglycoprotein,MEPE)最早是2000年由RowePS等人最早在腫瘤源性骨軟化癥(tumorinducedosteomalacia，TIO) 的腫瘤中提取得到的，并且將其命名為MEPE，隨后學(xué)者們將其定位為人的第4號(hào)染色體(4q21.1)，目前公認(rèn)MEPE是腫瘤細(xì)胞分泌的磷酸蛋白因子[1]。MEPE蛋白作為小型N端連接整合素家族蛋白 (smallintegrin-bindingligandN-linkedGlycoproteins,SBLING)的一員，其C端有一段酸性富含絲氨酸-天冬氨酸MEPE相關(guān)基序(acidicserine-aspartate-richMEPE-associatedmoti,fASARMmotif)[2，3]。

近10年來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可分析出SIBLINGs家族成員通過此序列與細(xì)胞表面整合素的結(jié)合來介導(dǎo)細(xì)胞黏附及信號(hào)傳導(dǎo)[4]，參與基質(zhì)的鈣化，骨質(zhì)、牙齒的形成，與細(xì)胞增殖能力有密切關(guān)系。不管是上皮來源還是間充質(zhì)來源的腫瘤當(dāng)中均能發(fā)現(xiàn)較高水平的SIBLING家族蛋白的表達(dá)。目前大量的研究發(fā)現(xiàn)，他們可參與腫瘤發(fā)展的許多階段，包括腫瘤細(xì)胞的初期的黏附增殖、以及局部侵襲和后期細(xì)胞外基質(zhì)的降解、腫瘤性血管的發(fā)生、逃避宿主免疫、腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(尤其是骨轉(zhuǎn)移)、以及各種腫瘤組織病理性鈣化的形成[5]。本實(shí)驗(yàn)通過相關(guān)檢測研究MEPE蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)行為的影響，以及其基因信號(hào)通路的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株、質(zhì)粒MEPEcDNA及質(zhì)粒pLEGEP-N(購于BDBiosciencesClontech公司)；293T細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞研究所)；大腸桿菌E.coliDH5T(本實(shí)驗(yàn)室提供)。PBS(1X)(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；PBS(Hclone公司)；RNAisoPlus(寶生物工程有限公司);LipofectamineTM2000;G-418Sulfate(GIBCO)。QIAprep質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen公司)；PCR產(chǎn)物純化Geneclean11試劑盒(Cat# 1001-400)(BIO101公司)；T4DNA連接酶(購自Takara生物公司)。

1.2 方法

1.2.1PCR擴(kuò)增、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及序列測定

擴(kuò)增MEPEcDNA全長，其擴(kuò)增引物:上游引物:5′一CATATGAAGCTGAATGAAGAT- 3；下游引物: 3′-GGATCCTTACATTTGGGGGAGATG- 3′，PCR擴(kuò)增的目的基因經(jīng)NdeI與BamHI雙酶切后，將pLEGEP-N1載體進(jìn)行同樣酶切處理，隨后將前者克隆到后者得到融合質(zhì)粒表達(dá)，通過感受態(tài)大腸桿菌DH5T挑去單克隆進(jìn)行篩選，選出一個(gè)或兩個(gè)陽性克隆進(jìn)行PCR測序，并進(jìn)行序列及讀碼框架結(jié)果正確與否的鑒定。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建

細(xì)胞生長狀態(tài)優(yōu)良且融合率達(dá) 90%以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照說明手冊(cè)將細(xì)胞轉(zhuǎn)染至6孔板加入胰酶消化48h后制備細(xì)胞懸液，稀釋細(xì)胞懸疑至原有懸液的10倍，將其鋪于96孔板內(nèi)，每孔分別加入600ug/mLG418完全培養(yǎng)基進(jìn)行克隆篩選，常規(guī)培養(yǎng)4周后克隆陽性細(xì)胞進(jìn)行鑒定并擴(kuò)增培養(yǎng)凍存。

1.2.3RT-PCR檢測

按照已購買的RNA提取試劑的操作說明書 ,用Trizol提取細(xì)胞總RNA。實(shí)驗(yàn)之前所用器具用DEPC水浸泡過夜,去除RNA酶。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p53基因的表達(dá)。p53引物上游:TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG,下游ATGTGCTGTGACTGC-TTGTAGATG。

1.2.4MTT檢測增殖能力

293T細(xì)胞生長密度至80%時(shí)常規(guī)胰酶消化、計(jì)數(shù) ,接種2000～3000個(gè)細(xì)胞至96孔板中，目的基因組、空載體組 ,每組 3個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至 2、4、6及 8d后 ,加入20μLMTT(濃度為5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸盡培養(yǎng)基。每孔加入150μLDMSO，室溫下振蕩10min，在酶標(biāo)儀上設(shè)定波長490nm測定并記錄各孔吸光度值。

圖1pLEGFP一N1-mepe轉(zhuǎn)染細(xì)胞及pLEGFP一N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞RT-PCR電泳圖

a：DL5OODNAmarker:b、c：空載體細(xì)胞及轉(zhuǎn)染目的基因的GAPDH表達(dá);d轉(zhuǎn)染MEPE質(zhì)粒細(xì)胞中MEPE表達(dá);e轉(zhuǎn)染EGFP細(xì)胞中MEPE表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的檢測

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA進(jìn)行PCR檢測，電泳圖結(jié)果顯示兩組細(xì)胞90bp附近均有GAPDH擴(kuò)增條帶出現(xiàn);目的基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增條帶出現(xiàn)在120bp;空載體組在120bp處無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，證明轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

2.2RT-PCR檢測相關(guān)因子表達(dá)情況

從產(chǎn)物電泳圖比較三種基因在兩種細(xì)胞中的不同表達(dá),見圖2。

2.3MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果

MTT檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染MEPE的293T細(xì)胞其增殖數(shù)量增加近1.3倍，見表1。

圖2 轉(zhuǎn)染MEPE及空載體細(xì)胞中基因表達(dá)

a.DL500DNAmarker;b. 轉(zhuǎn)染MEPE細(xì)胞中GAPDH表達(dá) ;c.轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞中GAPDH表達(dá);d.DL500DNAmarker;e. 轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞中p53 表達(dá) ;f. 轉(zhuǎn)染MEPE細(xì)胞中p53表達(dá)。

表1 MTT法檢測MEPE及EGFP空載體轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞增殖指數(shù)

注：P<0.05

3 討論

鑒于SIBLINGs家族成員在正常生理情況下與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞發(fā)揮功能密切相關(guān)，大量研究人員推測它與腫瘤骨轉(zhuǎn)移也必然有著千絲萬縷的聯(lián)系。近幾十年來的報(bào)道顯示腫瘤發(fā)展的許多階段包括腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成都與SIBLINGs家族蛋白密切相關(guān)。KaluU.E等人報(bào)道某些SIBLING家族成員蛋白以及其相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在腫瘤細(xì)胞表達(dá)水平提高，并且與腫瘤的不同發(fā)展階段密切相關(guān)。目前已知的三種蛋白包括BSP,OPN和DMP1，與MMPs有很高的親和力，很容易形成SIBLING-MMPs復(fù)合體從而行使多種功能，例如腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。CuiR等[7]研究顯示如果刻意阻斷OPN與血管發(fā)生的關(guān)鍵因子整合素受體αvβ3相互作用時(shí)，可見大鼠體內(nèi)的肺癌細(xì)胞生長緩慢甚至停滯。SharpJA等[8]人研究發(fā)現(xiàn)注射轉(zhuǎn)染中的IBSP基因到裸鼠體內(nèi)可使其體內(nèi)乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞增殖水平提高，顯示骨唾液蛋白(BSP)能夠加劇腫瘤發(fā)生。通過對(duì)以上體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,我們可以證實(shí)SIBLING家族成員蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞有較大的影響,本實(shí)驗(yàn)通過檢測結(jié)果證明MEPE蛋白表達(dá)水平的對(duì)細(xì)胞增殖的生物學(xué)特性的影響,且PCR電泳圖結(jié)果證實(shí)其作用機(jī)制是通過p53蛋白信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。臨床上腫瘤具有增殖失控，侵襲，轉(zhuǎn)移等共性，這些特點(diǎn)是治療腫瘤致命的要點(diǎn)，MEPE的研究成果為探索癌的發(fā)生機(jī)制，早期診斷及預(yù)后判斷標(biāo)志提供了多方面的線索，大大提高了對(duì)癌癥早期發(fā)現(xiàn)幾率，抓住治療時(shí)機(jī)，為惡性腫瘤的基因治療奠定了基礎(chǔ)。雖然目前基因治療尚未在臨床普及,但大量研究顯示此種療法具有優(yōu)良的應(yīng)用前景。此外對(duì)于MEPE對(duì)腫瘤細(xì)胞的其他生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制的研究還不完善，有待進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)的探索。

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黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12521553。

李善昌(1969～ )男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

Q25;Q

A

1008-0104(2017)03-0010-02

2017-03-05)