基于TLR4／NF-κB信號通路研究調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸干預原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠的作用機制*

郭琲婷 郭曉霞

山西省中醫(yī)藥研究院2014級碩士研究生班 （山西 太原，030012）

基于TLR4／NF-κB信號通路研究調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸干預原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠的作用機制*

郭琲婷 郭曉霞△

山西省中醫(yī)藥研究院2014級碩士研究生班 （山西 太原，030012）

目的：通過研究腫瘤壞死因子-a（TNF-α）及Toll樣受體4／核轉(zhuǎn)錄因子κB（TLR4／NF-κB）信號通路相關(guān)基因在原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）模型小鼠回腸組織中的表達情況，探討中藥調(diào)肝理脾方（TGLP）聯(lián)合熊去氧膽酸（UDCA）干預PBC小鼠的作用機制。方法：將100只C57BL／6雌性小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性組（UDCA 0.1g·kg－1·d－1）、中藥組（TGLP 5.4g·kg－1· d－1）、聯(lián)合組（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1），每組20只；采用聚肌胞苷酸（poly l：C）5mg／kg復制PBC小鼠模型；給藥8w、16w后頸脫位法處死小鼠，采集末端回腸，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法及實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測回腸組織中TLR4、TNF-α的表達水平，RT-PCR法測定回腸組織中TLR4、NF-κBmRNA的相對表達水平。結(jié)果：與模型組比較，正常組小鼠回腸組織中NF-κB、TNF-α表達水平較低，差異有顯著性意義（P＜0.01）；經(jīng)治療后3個治療組小鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表達水平均較模型組降低，差異有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05），且聯(lián)合組小鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表達水平下降最顯著；與聯(lián)合組相比，中藥組小鼠NF-κB表達水平較高，差異有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論：負性調(diào)節(jié)小鼠回腸組織中TLR4／NF-κB信號通路并抑制TNF-α因子的釋放可能是TGLP聯(lián)合UDCA干預PBC模型小鼠的作用機制之一。

原發(fā)性膽汁性膽管炎；調(diào)肝理脾方；TLR4／NF-κB信號通路；TNF-α

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）是一種病因未明的以慢性進行性、非化膿性、肝內(nèi)小膽管破壞、膽汁淤積性為特征的自身免疫性疾病，好發(fā)于中年女性，可逐漸發(fā)展到肝纖維化、肝硬化，最終導致肝衰竭而需肝臟移植［1］。近年來國內(nèi)外基礎(chǔ)與臨床研究表明，多種肝病的發(fā)生、發(fā)展與腸道微生態(tài)的變化關(guān)系密切，有學者指出［2，3］，PBC患者中腸道微生物可能通過腫瘤壞死因子-a（TNF-α）發(fā)揮致病或免疫調(diào)節(jié)的作用，而TNF-α的產(chǎn)生與Toll樣受體4／核轉(zhuǎn)錄因子κB（TLR4／NF-κB）信號通路密切相關(guān)。調(diào)肝理脾方是郭曉霞導師在長期臨床工作中擬定的經(jīng)驗方，經(jīng)過臨床反復驗證，該方可明顯改善PBC患者的肝纖維化程度及生存質(zhì)量。前期動物實驗研究證明，調(diào)肝理脾方對PBC小鼠慢性肝損傷及小膽管改變具有很好的防護作用［4］，我們選用調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸，觀察其對PBC模型小鼠回腸組織中TNF-α及TLR4、NF-κB表達水平的影響，探討調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸干預PBC的作用機制?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物選用5-6周雌性SPF級C57BL／6小鼠100只，體質(zhì)量18±2g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥物 熊去氧膽酸膠囊（公司：Dr.Falk Pharma GmbH，生產(chǎn)企業(yè)：Losan Pharma GmbH，產(chǎn)品批號：12K21424L），規(guī)格250mg／粒，25粒／盒。實驗室用雙蒸水配制成濃度為0.5%的混懸液。調(diào)肝理脾方由以下藥物組成：炙黃芪、丹參、枸杞子各30g，山藥20g，白術(shù)、茯苓各15g，柴胡、姜黃、羌活、忍冬藤各10g，陳皮6g，郁金12g，均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供的免煎顆粒。根據(jù)前期研究，選用療效最佳的中劑量，在實驗室用雙蒸水配制成濃度為66.7%的免煎溶液。

1.3 主要試劑及儀器 聚肌胞苷酸Poly C（美國Amersco公司），小鼠TNF-αELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司），EasyPure?RNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司，ER101），TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，AT301），QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit（德國QIAGEN公司）。組織勻漿機（德國IKA公司，T25 ULTRA-TURRAX），微孔板檢測儀（美國BioTek公司，Synergy H1）；低溫臺式離心機（美國Beckman Coulter公司，Auegrax-30k），Veriti定性PCR儀（美國Applied Biosystems公司，9902），熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司，7500）。

1.4 動物分組及處理 實驗動物自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1w后，稱取體重。采用Excel隨機分組方法［5］，根據(jù)體重隨機分組設計，生成隨機數(shù)字，將100只C57BL／6小鼠隨機分配到5個實驗組中，每組20只，分別是正常組、模型組、陽性組（UDCA 0.1g·kg－1·d－1）、中藥組（TGLP 5.4g·kg－1·d－1）、聯(lián)合組（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1）。參考文獻報道［6～8］，除正常組外，其余4組小鼠均腹腔注射聚肌胞苷酸（poly l：C）5mg／kg，正常組小鼠予等體積生理鹽水腹腔注射，2次／w，連續(xù)16周。8周、16周時頸脫位法處死小鼠（處理前禁食一天），每個時間點10只，采集末端回腸，0.9%生理鹽水沖洗后保存于-80℃冰箱以備檢測。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 腸組織中TNF-α的檢測 使用ELISA檢測試劑盒檢測腸組織中TNF-α濃度。步驟參照試劑盒說明。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法測定腸組織中TNF-αmRNA的表達水平。步驟參照試劑盒說明。引物序列見表1。

1.5.2 腸組織中TLR4、NF-κB的檢測 采用RT-PCR法檢測腸組織中TLR4mRNA、NF-κBmRNA表達水平。步驟參照試劑盒說明。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況 實驗過程中，正常組死亡1只，模型組死亡1只，陽性組死亡2只，聯(lián)合組死亡3只中藥組死亡0只，共死亡7只老鼠，均因灌胃后出現(xiàn)死亡，解剖后未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變，考慮可能與灌胃時操作不當有關(guān)。

2.2 各組小鼠腸組織中TNF-α的表達水平 見表2。

表2 各組小鼠腸組織中TNF-α表達水平比較 （±s）

表2 各組小鼠腸組織中TNF-α表達水平比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

正常組8 153.00±21.35**153.81±10.31**模型組8 230.61±40.39 236.86±43.55陽性組8 189.31±17.33**180.33±28.06**中藥組8 194.95±31.40*198.32±36.64*聯(lián)合組8 179.73±24.17**176.17±24.03**

2.3 各組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA的表達水平（2△△CT值）（見圖1到圖4） 各實驗組內(nèi)參基因β-actin和TLR4、NF-κB、TNF-α熔解曲線中均有單一的主峰，熔解溫度為85℃，相同擴增條件下重復多次，得到的β-actin和TLR4、NF-κB、TNF-α熔解溫度均在85℃左右，變化不超過1℃，說明所擴增的產(chǎn)物具有特異性。

圖1 β-actin內(nèi)參基因溶解曲線

圖2 TLR4基因溶解曲線

圖3 NF-κB基因溶解曲線

圖4 TNF-α基因溶解曲線

根據(jù)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果及2△△CT值顯示，與模型組比較，正常組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-α基因表達水平較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各治療組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-α基因表達水平有不同程度的下降但均高于正常組，其中聯(lián)合組下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。與聯(lián)合組比較，中藥組TLR4、TNF-α基因表達水平較高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NF-κB基因表達水平較組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。與聯(lián)合組比較，陽性組TLR4、NF-κB、TNF-α基因表達水平均有升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA表達水平2△△CT的比較 （±s）

表3 各組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA表達水平2△△CT的比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)合組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別n 8周TLR4 NF-κB TNF-α 16周TLR4 NF-κB TNF-α正常組8 0.24± 0.92**0.18± 0.05**0.30± 0.15**0.22± 0.82**0.26± 0.14**0.29± 0.14**模型組8 1.07± 0.17 1.00± 0.13 1.04± 0.10 1.06± 0.22 1.01± 0.13 1.03± 0.07陽性組8 0.53± 0.21**0.51± 0.13**0.66± 0.12**0.49± 0.12**0.51± 0.16**0.65± 0.21**中藥組8 0.67± 0.26*0.59± 0.15**＃＃0.70± 0.24**0.62± 0.17**0.58± 0.12**＃0.70± 0.16**陽性＋中藥組8 0.47± 0.20**0.34± 0.10**0.49± 0.12*0.45± 0.07*0.35± 0.12**0.49± 0.14**

3 討論

PBC是一種病因未明的自身免疫性、慢性進行性肝臟疾病，其病理特點以肝內(nèi)細小膽管的非化膿性破壞、匯管區(qū)炎癥、膽汁淤積、肝纖維化為主，可發(fā)展為肝硬化，最終導致肝衰竭而需肝臟移植。PBC多見于中老年女性［10］，最常見的臨床表現(xiàn)為乏力和皮膚瘙癢。全球范圍內(nèi)PBC的年發(fā)病率為0.33～5.8／10萬，患病率為1.91～40.2／10萬［11］；我國的發(fā)病率雖無大樣本流行病學調(diào)查結(jié)果，但近年來PBC的發(fā)病率及檢出率逐漸增多，2010年在對廣州當?shù)厝说恼{(diào)查中顯示，PBC的患病率為49.2／10萬，其中40歲以上女性的患病率為155.8／10萬。血清抗線粒體抗體（AMA）陽性，特別是AMA-M2亞型陽性對本病診斷具有很高的敏感性和特異性。

中醫(yī)學沒有PBC病名，根據(jù)疾病階段及臨床表現(xiàn)將其歸屬于“脅痛”、“積聚”、“黃疸”、“鼓脹”等病癥。歷代醫(yī)家對病因病機的認識各不相同，張景岳將脅痛的病因分為外感和內(nèi)傷。肝為將軍之官，性喜條達，調(diào)暢氣機，情志不遂、飲食不節(jié)、外感濕熱、病后所致等均可受累于肝，發(fā)為本病。結(jié)合文獻查閱［12，13］及前期研究［14］發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛是PBC患者的基本證型，研究中采用腹腔注射聚肌胞苷酸C57BL／6小鼠，成功建立了早期PBC小鼠動物模型，經(jīng)郭曉霞導師經(jīng)驗方調(diào)肝理脾方干預后，通過肝組織病理及超微結(jié)構(gòu)觀察肝損傷情況，結(jié)果提示調(diào)肝理脾方可有效抑制膽小管的增生及膠原纖維的沉積。調(diào)肝理脾方以柴芍六君子湯為基礎(chǔ)方，佐以枸杞子、黃芪、丹參補腎以固本，忍冬藤、羌活祛風勝濕，共奏調(diào)肝健脾、補腎祛濕之效。熊去氧膽酸（UDCA）是經(jīng)隨機對照試驗研究證實的安全有效的治療藥物［15］，雖能夠改善生物化學和臨床指標，但并不能真正改善患者的遠期生存率和對肝移植的需求，對UDCA生化應答欠佳的患者，目前尚無統(tǒng)一的治療方案。前期研究表明［15］，調(diào)肝理脾方聯(lián)合UDCA治療PBC較單用中藥或西藥的效果更好。本研究沿用上述方法成功建立PBC動物模型，對調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸改善PBC模型小鼠的作用機制進行了探討。

Toll樣受體（TLRs）是介導天然免疫及病原體信號轉(zhuǎn)導與細胞活化信號轉(zhuǎn)導的重要跨膜信號傳遞受體，可識別高度保守的微生物組分—病原相關(guān)分子模式（PAMPS），在B淋巴細胞、NK細胞、單核-巨噬細胞及樹突狀細胞表面都有分布，主要在天然免疫系統(tǒng)的細胞上表達。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少15種TLRs。由TLRs介導的信號轉(zhuǎn)導通路可以誘導很多反應的快速活化，產(chǎn)生一氧化氮合成酶、抗菌肽、炎癥細胞因子、共刺激分子、趨化細胞因子等效應分子，激活炎癥反應，參與機體防御反應［16］。目前研究以TLR4／NF-κB信號傳導途徑較多且最為明確，在Yoon等［17］用LPS刺激BV2細胞所造成的炎癥模型中，TLR4和NF-κB蛋白表達相對于對照組均有所增高。TLR4介導的MyD88依賴性途徑作為經(jīng)典傳導途徑，其主要激活NF-κB并促使細胞因子的產(chǎn)生［18］。NF-κB是真核細胞中普遍存在的一類具有多向性調(diào)節(jié)作用的誘導性核轉(zhuǎn)錄因子，這些基因編碼促炎細胞因子和內(nèi)在免疫和急性時相反應蛋白［19，20］，廣泛調(diào)控著免疫反應、應激反應和炎癥反應相關(guān)的基因表達。

在多種肝臟疾病，如病毒性肝炎、酒精性肝病、肝硬化和肝癌患者中大部分存在腸道菌群的移位和腸源性內(nèi)毒素血癥［21］，動物實驗也證實腸源性內(nèi)毒素在肝纖維化［22］和酒精性肝?。?3］的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，PBC也存在由各種因素通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多機制造成腸粘膜損傷，引起一系列的并發(fā)癥。引起損傷的各種因素中，促炎細胞因子起了重要作用，TNF-α是公認的促炎細胞因子，其產(chǎn)生與TLR4／NF-κB信號通路密切相關(guān)。炎癥反應中，促炎因子如TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8對NF-κB轉(zhuǎn)錄家族的激活將誘導其基因轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生更多的細胞因子［24］，加重腸粘膜損傷。

本次研究基于TLR4／NF-κB信號通路，采用ELISA法及實時熒光定量PCR技術(shù)對PBC小鼠末端回腸中促炎細胞因子TNF-α進行了檢測，結(jié)果顯示TGLP聯(lián)合UDCA可降低TNF-α的表達水平，同時，我們采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測PBC模型小鼠末端回腸中TLR4mRNA、NF-κBmRNA，結(jié)果顯示TGLP聯(lián)合UDCA亦可同時降低TLR4、NF-κB的表達水平。研究結(jié)果提示，TGLP聯(lián)合UDCA干預PBC模型小鼠時，可通過負性調(diào)節(jié)TLR4／NF-κB信號通路，進而抑制TNF-α細胞因子的釋放，減輕腸粘膜的損傷。這對于探討中藥聯(lián)合UDCA以減輕腸粘膜損傷，改善肝臟損傷來干預PBC的作用機制及作用靶點有重要意義，未來有望通過多中心、大樣本統(tǒng)計的研究方式，為治療PBC提供新的臨床思路。

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Investigation on themechanism of TLR4／NF-κB signaling pathway in the treatment of primary biliary cholangitis in m ice w ith Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid

GUO Bei-ting，GUO Xiao-xia.Shanxi research institute of traditional Chinesemedicine（Taiyuan Shanxi，030012）China

Objective：TO study the hemechanism of TLR4／NF-κB signaling pathway in the treatment of primary biliary cholangitis in mice with Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid.Methods：100 C57BL／6 femalemice were randomly divided into normal group，model group，positive group（UDCA 0.1g·kg－1·d－1），Chinesemedicine group（TGLP5.4g·kg－1·d－1）and drug combination group（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1），20 in each group.Establish PBC animalmodel by injectingwith cytidine polyinosinic acid（poly l：C）5mg／kg to them.Allmicewere executed through cervical dislocationmethod after8 and 16 weeks and fasted for24h before processing.Terminal ilea were taken outand cleaned in 0.9%saline，and then stored in－80℃refrigerator for detection.With themethod of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR）.The level of TNF-α，TLR4 and NF-κBmRNA were detected through ELISA and PCR，respectively.Results：Compared with themodel group，the expression levels of NF-κB and TNF-αin the normal group ilea were lower，a statistically significant difference（P＜0.01）.By comparison，the expression level of TLR4 in the normal group was lower than that in themodel group，withouta statistically significant difference（P＞0.05）.The expression levels of TLR4，NF-κB and TNF-αin the treatment groupswere lower than that in themodel group，a statistically significant difference（P＜0.01 orP＜0.05），decreasing significantly in the drug combination group.Compared with the drug combination group，the expression level of NF-κB in the Chinesemedicine group was higher，a statistically significant difference（P＜0.01 orP＜0.05）.Conclusion：Negatively regulating TLR4／NF-κB signal pathway and reducing the release of TNF-αin the ileum tissuemay be one of the actionmechanism in the treatmentof primary biliary cholangitis in mice with Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid.

primary biliary cholangitis；Tiaogan Lipi decoction；TLR4／NF-κB signal pathway；TNF-α

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.013

2016－08－30 編輯：肖明中）

山西省自然科學基金面上項目（No.2015011102）；△通訊作者，E-mail，245467575＠qq.com