雙波長法測定山藥中直鏈和支鏈淀粉含量

崔晉，李建軍，馬艷弘，李亞輝，魏建明，郝林

（1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西晉中030801；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；3.江蘇博達生物科技有限公司，江蘇徐州221723）

雙波長法測定山藥中直鏈和支鏈淀粉含量

崔晉1，2，李建軍2，馬艷弘2，李亞輝2，魏建明3，郝林1，*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西晉中030801；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；3.江蘇博達生物科技有限公司，江蘇徐州221723）

使用雙波長分光光度法測定不同品種山藥中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，根據(jù)雙波長法的測定原理，確定山藥直鏈及支鏈淀粉的測定波長和參比波長，直鏈淀粉分別為624 nm和410 nm，支鏈淀粉分別為538 nm和758 nm。試驗結(jié)果表明，該測定方法標準曲線良好。直鏈淀粉在0～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其碘復(fù)合物與吸光度呈線性關(guān)系（R2=0.999 7），支鏈淀粉在0～250 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其碘復(fù)合物與吸光度呈線性關(guān)系（R2=0.998 4）。山藥中直鏈淀粉含量為0.026 mg/mL，回收率在96.72%～98.73%之間；支鏈淀粉的含量為0.072 mg/mL，回收率在95.74%～97.87%之間，RSD均小于1.5%。

山藥；雙波長分光光度法；直鏈淀粉；支鏈淀粉

山藥為薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.），屬草本蔓生性植物，塊莖呈長紡錘至柱形。目前已有品種600多種，其肉質(zhì)柔滑，富含維生素、微量元素、蛋白質(zhì)、多糖、薯蕷皂甙、尿囊素、尿囊酸等保健功能較強的生物活性物質(zhì)，尤其是其紫山藥品種，還含有抗氧化活性較強的花青素[1-2]、具有很高的食用價值和開發(fā)前景。山藥中含有大量淀粉，是重要的優(yōu)質(zhì)淀粉來源，然而當前對植物淀粉的研究大多集中在玉米淀粉和馬鈴薯淀粉上，對山藥淀粉的開發(fā)利用卻鮮有報道。極大的限制了山藥淀粉的開發(fā)應(yīng)用和山藥深加工技術(shù)的發(fā)展。

淀粉是由脫水葡萄糖通過α-D-（1-4）糖苷鍵鏈接形成的高分子碳水化合物，其測定方法主要有傳統(tǒng)的旋光法[3]、水解總糖測定法[4]、蒽酮比色法[5]、三波長比色法和酶法淀粉測定法，以及近幾年發(fā)展起來的雙波長檢測法。傳統(tǒng)的測定方法操作繁瑣，測定結(jié)果易受樣品中糖分、脂類等物質(zhì)的干擾，且無法區(qū)分直鏈、支鏈淀粉。而雙波長法作為近年來興起的一種能同時測定直鏈和支鏈淀粉的方法，具有準確性高、重復(fù)性好、效率高，具有三波長比色法、酶法淀粉測定法不可比擬的優(yōu)點[6-10]，目前已被廣泛應(yīng)用于小麥、銀杏、板栗、高粱[11-13]等淀粉的分析測定。

通常植物中淀粉的含量和比例對其營養(yǎng)品質(zhì)與加工特性有較大影響[14]，而栽培品種和種植地區(qū)的差異均會造成山藥直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量變化，因此本文采用雙波長分光光度法建立了快速檢測山藥淀粉的檢測方法，并且分析了不同品種山藥淀粉的含量與組分差異，為進一步開展山藥品質(zhì)分析、保健食品開發(fā)以及資源的綜合利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試山藥資源：采自江蘇省農(nóng)科院試驗基地；直鏈淀粉與支鏈淀粉標準品：美國sigma公司；其余常規(guī)試劑石油醚、氫氧化鉀、鹽酸、碘、碘化鉀均為國產(chǎn)分析純試劑。

碘試劑的配制：準確稱取18.5 g碘化鉀，用少量蒸餾水溶解，再加入6.5 g碘，攪拌溶解后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中備用。

1.2 儀器與設(shè)備

D-8紫外可見分光光度計：南京菲勒儀器有限公司；ML204萬分之一天平、FE20-K pH計：梅特勒儀器有限公司；DHG-9076A電熱鼓風干燥箱、DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FW100萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；SZF-06A粗脂肪測定儀：上海新嘉電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉標準工作液的制備[15]

準確稱取直鏈淀粉標準品和支鏈淀粉標準品各0.100 0 g，分別放入100 mL燒杯中，加1 mol/L氫氧化鉀溶液10 mL，置于85℃水浴中充分攪拌溶解，然后用蒸餾水定容至50 mL，混合均勻，即為2.0 mg/mL的直鏈淀粉標準工作液和2.0 mg/mL的支鏈淀粉標準工作液。

1.3.2 直鏈淀粉與支鏈淀粉檢測波長的確定

吸取1.0 mL直鏈淀粉標準工作液和5 mL支鏈淀粉標準工作液，分別放入100 mL燒杯中，加蒸餾水25 mL，用0.1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH值至3.0，再加入0.02 mL碘試劑，并用蒸餾水定容至50 mL。室溫下靜置25 min后以蒸餾水為空白對照，分別在紫外-可見光分光光度計上進行400 nm～800 nm波段光譜掃描，分別獲得二者的吸收光譜圖，根據(jù)等吸收點作圖法確定直鏈淀粉的測定波長（λ1）和參比波長（λ3），以及支鏈淀粉的測定波長（λ2）和參比波長（λ4）。

1.3.3 直鏈淀粉與支鏈淀粉標準曲線的繪制

分別取直鏈淀粉標準工作液 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL于燒杯中，加蒸餾水25 mL，以鹽酸溶液調(diào)pH值至3.0，加0.02 mL碘試劑，用蒸餾水定容至50 mL。室溫下靜置25 min，在λ1和λ2波長下分別測定吸光度 ODλ1、ODλ2，以二者的差值△OD 值為縱坐標，直鏈淀粉濃度為橫坐標，即可繪制出雙波長直鏈淀粉標準曲線；分別取支鏈淀粉標準工作液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于燒杯中，其他操作同直鏈淀粉，根據(jù)結(jié)果即可繪制支鏈淀粉標準線。

1.3.4 山藥的處理與淀粉含量的測定

山藥進行切片處理，置于60℃鼓風干燥箱中烘干至恒重，然后用萬能粉碎機將樣品打成粉末，稱重，測得水分含量W1；稱取1.000 g烘干樣品（M），利用粗脂肪測定儀，加入80 mL石油醚，加熱回流脫脂4 h，然后放入干燥箱中烘干至恒重，測出粗脂肪含量W2。再稱取脫脂樣品0.100 g，加入1 mol/L的氫氧化鉀10 mL，于85℃水浴中充分攪拌溶解后，用蒸餾水定容至50 mL，靜置20 min后過濾。各品種均取濾液3mL，加入25 mL蒸餾水，以鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，樣品測定液中加碘試劑0.02 mL，測定液和空白液均用蒸餾水定容至50 mL。室溫靜置25 min后，以蒸餾水為空白對照，測定各樣品吸光值。再根據(jù)直、支鏈淀粉的雙波長標準曲線算出樣品的直、支鏈淀粉含量，二者相加即得烘干樣品總淀粉含量。直鏈淀粉和支鏈淀粉含量計算公式分別如下：

1.3.5 雙波長法的測定穩(wěn)定性、測定精度與加標回收率試驗

分別取直鏈淀粉和支鏈淀粉標準液，每隔5分鐘測定一次吸光值，計算平均值和相對標準偏差RSD值，評價雙波長檢測的穩(wěn)定性；對同一紫山藥樣品同時測定直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，進行4次重復(fù)測定，計算結(jié)果的平均值與RSD值，評價其測定精度；在已測得直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的紫山藥樣品中，分別添加準確稱量的不同質(zhì)量的直鏈淀粉和支鏈淀粉標準品，測定支鏈淀粉與直鏈淀粉含量，按照下列公式計算加標回收率及RSD值，以此檢驗雙波長法測定紫山藥淀粉含量的準確度。

式中：m1為加標準品后樣品測定的總質(zhì)量，mg；m2為樣品中原有直鏈或支鏈淀粉的質(zhì)量，mg；m3為添加的直鏈或支鏈淀粉標準品的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈淀粉測定波長及參比波長的選擇

根據(jù)雙波長分光光度法測定原理[16]，采用作圖法選定參比波長和測定波長。用D-8紫外可見分光光度計分別對直鏈淀粉、支鏈淀粉標準溶液進行掃描得到吸收光譜。選擇波長需要具備兩個基本條件，一是同存組分在這兩個波長應(yīng)具有相同的吸收值，使其濃度變化不影響到測定值，二是待定組分在這兩個波長的差值應(yīng)足夠大[17]。直鏈淀粉、支鏈淀粉測定波長與參比波長分析見圖1。

圖1 直鏈淀粉、支鏈淀粉測定波長與參比波長分析Fig.1 The analysis of determination wavelength and reference wavelength of amylose and amylopectin

根據(jù)掃描圖譜和等吸收點作圖法的原理，確定直鏈淀粉和支鏈淀粉最大吸收波長分別為624 nm和538nm，確定直鏈淀粉測定雙波長為624nm和410nm，支鏈淀粉測定雙波長為538 nm和758 nm。

2.2 直鏈淀粉及支鏈淀粉標準曲線的繪制

以蒸餾水為空白，采用雙波長分光光度法在測定波長624 nm，參比波長410 nm下分別測定吸光度。以直鏈淀粉含量為橫坐標，以ΔA直=Aλ1-Aλ3為縱坐標繪制標準曲線（見圖2）。直鏈淀粉回歸方程為y=20.15x-0.121 2，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 7。

以蒸餾水為空白，采用雙波長分光光度法在測定波長624 nm，參比波長410 nm下分別測定吸光度。以支鏈淀粉含量為橫坐標，以ΔA支=Aλ2-Aλ4為縱坐標繪制標準曲線（見圖3）。支鏈淀粉回歸方程為y=2.105 7x-0.023 5，相關(guān)系數(shù) R2=0.998 4。

圖2 直鏈淀粉標準曲線Fig.2 Calibration curve of amylose determination

圖3 支鏈淀粉標準曲線Fig.3 Calibration curve of amylopectin determination

2.3 雙波長測定方法的穩(wěn)定性試驗

取直鏈淀粉和支鏈淀粉標準液，每隔5分鐘測吸光值見表1。

表1 直鏈淀粉和支鏈淀粉在不同測定時間的吸光值Table 1 The absorbance value of amylase and amylopectin in different reaction time

由表1可知，在15min～40min區(qū)間內(nèi)，直鏈淀粉和支鏈淀粉溶液的吸光值的相對偏差RSD＜1%，15 min～40 min范圍內(nèi)檢測結(jié)果基本穩(wěn)定，表明試驗的重復(fù)性好，說明雙波長的檢測結(jié)果相對穩(wěn)定。

2.4 雙波長法測定精密度評價

取其中的4種山藥進行精密度試驗，經(jīng)過相同處理的紫山藥進行重復(fù)測定4次，結(jié)果見表2。

可以看出，雙波長法進行淀粉的測定的試驗方法重復(fù)性良好，具有較高的精密度。

2.5 樣品加標回收率測定結(jié)果

為了檢測山藥淀粉含量測定結(jié)果的準確性，在已測得直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的樣品中，在處理好的山藥樣品中添加直鏈淀粉和支鏈淀粉標準品，求得其回收率見表3。由表3可見，直鏈淀粉和支鏈淀粉其回收率在95.74%～98.73%之間，RSD均小于1.5%，滿足檢測要求，說明該分析檢測方法具有較高的準確度，適用于同時測定山藥樣品中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。

表2 樣品測定重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Results of repeated determinations of amylose and amylopectin in cassava starch

表3 直鏈淀粉和支鏈淀粉回收率Table 3 Spike recovery rates of amylose and amylopectin

2.6 不同山藥的淀粉含量變化

測定不同山藥的水分、脂肪及淀粉含量見表4。由表4可見，供試樣品水分含量在1.12%～8.82%，脂肪含量在1.1%～2.8%之間；烘干樣品中直鏈淀粉含量在15.2%～27.3%之間，支鏈淀粉含量在43.8%～77.72%之間，總淀粉含量在67.7%～93.09%之間。

表4 山藥樣品中直鏈和支鏈淀粉含量的測定結(jié)果Table 4 Determination results of amylase and amylopectin in purple yam

3 結(jié)論

雙波長法作為近年來發(fā)展的一種能同時測定直鏈和支鏈淀粉的方法，具有準確性高、重復(fù)性好、效率高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物淀粉含量的快速檢測中。本文采用雙波長分光光度法，研究了碘試劑與直鏈淀粉和支鏈淀粉的顯色反應(yīng)，測定了山藥的淀粉含量、直鏈淀粉含量和支鏈淀粉含量。根據(jù)其光譜掃描結(jié)果，確定直鏈淀粉的測定波長為624 nm，參比波長為410 nm，支鏈淀粉的測定波長為538 nm，參比波長為758 nm。直鏈淀粉在濃度為0～50 μg/mL范圍內(nèi)與吸光值呈線性關(guān)系，回歸方程為：y=20.15x-0.121 2，R2=0.999 7，支鏈淀粉在濃度為 0～250 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光值呈線性關(guān)系，回歸方程為：y=2.105 7x-0.023 5，R2=0.998 4。采用雙波長法測定紫山藥中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，二者的平均回收率分別為97.67%和96.69%，精密度高，RSD均小于1.5%，此方法可用于測定山藥中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量準確檢測試驗中。

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Dual-wavelength Spectrophotometry Method for Measuring Amylase and Amylopectin Contents of Yam

CUI Jin1，2，LI Jian-jun2，MA Yan-hong2，LI Ya-hui2，WEI Jian-ming3，HAO Lin1，*
（1.College of Food Science and Nutrition Engineering，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，Shanxi，China；2.Institute of Agricultural Products Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；3.Jiangsu Boda Biotechnology Ltd.，Xuzhou 221723，Jiangsu，China）

Dual-wavelength spectrophotometry was applied to the determination of amylase and amylopectin content in yam.According to the principle of dual-wavelength method determination，determine the purple yam starch measure wavelength and reference wave length.Absorbencies at 624 nm and 410 nm were used for amylose content measurement，absorbencies at 538 nm and 758 nm were used for amylopectin content measurement.An excellent linear relationship between starch-iodine complex and absorbance was achieved in the range of 0-50 μg/mL（R2=0.999 7）for amylose and 0-250 μg/mL（R2=0.998 4）for amylopectin.The content of amylase was 0.026 mg/mL and the average recovery was between 96.72%and 98.73%.The content of amylopectin was 0.072 mg/mL and the average recovery was between 95.74%and 97.87%，and the RSD were both less than 1.5%.

yam；dual-wavelength spectrophotometry；amylase；amylopectin

2017-03-30

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項目（CX（16）1019）

崔晉（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：郝林（1957—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.031