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    熱處理對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

    2017-07-01 19:51:23鄒忠義黃斐孫建利馮志石瑞婷李洪軍
    食品研究與開發(fā) 2017年13期
    關(guān)鍵詞:烯醇工作液衍生物

    鄒忠義,黃斐,孫建利,馮志,石瑞婷,李洪軍

    (1.公安海警學(xué)院后勤管理系,浙江寧波315801;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶400716)

    熱處理對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

    鄒忠義1,黃斐1,孫建利1,馮志1,石瑞婷1,李洪軍2,*

    (1.公安海警學(xué)院后勤管理系,浙江寧波315801;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶400716)

    研究熱處理對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和T-2毒素的去除作用。測試不同溫度、不同加熱時(shí)間、不同pH值條件下熱處理對DON和T-2毒素影響,采用高效液相色譜-質(zhì)譜測定毒素及其衍生物,采用外標(biāo)法定量。DON在中酸性條件下,121℃加熱60 min,DON濃度保持穩(wěn)定,堿性條件能促進(jìn)DON的熱降解。T-2毒素在中酸性條件下,105℃加熱30 min開始降解,121℃處理pH值為7的1.0 μg/mL T-2毒素溶液60min,T-2毒素去除率分別為(51.98±3.37)%,堿性條件能促進(jìn)T-2毒素的熱降解。在一定條件下,熱處理對DON、T-2毒素具去除作用。

    脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON);T-2毒素;熱處理;去除

    單端孢霉烯族毒素(trichothecenes)是由鐮刀菌等產(chǎn)生的一類真菌毒素[1],它包含多種毒素,其中最具有代表性是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和T-2毒素[2-3],對人和動(dòng)物具有多種毒性[4-5]。它們廣泛存在于各種環(huán)境中[6],目前還沒有完全有效的適宜去除方法,給糧食和飼料產(chǎn)業(yè)帶來大量經(jīng)濟(jì)損失,也給食品安全帶來一定隱患,所以必須采取有效的措施來控制這類毒素的污染[7]。

    大多數(shù)真菌毒素在常規(guī)食品加工溫度范圍內(nèi)對熱具有抵抗力,在通常烹飪條件下,例如常壓蒸煮、巴氏滅菌,真菌毒素含量降低很少或不降低[8]。Ryu等[9]、Bullerman等[10]對這方面研究進(jìn)行了綜述,提到DON等毒素對熱穩(wěn)定,會(huì)一定程度上保留在加工后的產(chǎn)品中。本工作將研究熱處理對單端孢霉烯族毒素去的除作用,探索去除此類毒素的方法。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    DON、T-2 毒素、脫環(huán)氧 DON(deepoxy-deoxynivalenol,DOM-1)、DON-3-葡萄糖苷、15-乙酰-DON(15-acetyl-deoxynivalenol,15-A-DON)、3-乙酰-DON(3-acetyl-deoxynivalenol,3-A-DON)、T-2 四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2毒素、新茄病鐮刀菌烯醇(neosolaniol,NEO)(純度均≥99%)、正己烷、乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸(均為色譜純)、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純):美國Sigma-Aldrich公司。

    1.2 主要儀器

    CPA225D電子天平:德國Sartorius公司;Finnpipette移液器:美國Thermo Scientific公司;XW-80A漩渦混合器:江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;S20P-K pH計(jì):瑞士Mettler-Toledo公司;SW22恒溫振蕩器:德國JULABO公司;LABO AUTOCLANE MLS-3780高壓滅菌鍋:日本SANYO公司;SIGMA 3-30k離心機(jī):美國Sigma-Aldrich公司;N-EVAPTM 116氮吹儀:美國Organomation Associates公司;Polytetrafluoroethylene濾膜(17 mm,0.22 μm):丹麥 Frisenette公司。Sciex API 4000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源及Analyst software 1.5.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)):美國Applied Biosystems公司;UFLC LC-20AD高效液相色譜儀、Shim-peak UP-ODS分離柱(150 mm×4.6 mm,3.0 μm)、Shim-peak GPRC-ODS保護(hù)柱(8 mm×1.5 mm,5.0 μm):日本Shimadzu公司。

    1.3 主要方法

    1.3.1 制備毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液

    制備毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精確分別稱取DON、T-2及其衍生物(DOM-1、15-A-DON、3-A-DON、DON-3-葡萄糖苷、T-2四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2、NEO)5.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL容量瓶中,用乙腈溶解成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,避光-20℃條件下保存。

    制備毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別用超純水稀釋、定容毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制成0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg/mL 的毒素、毒素衍生物及其混合物的標(biāo)準(zhǔn)工作液,避光4℃條件下保存。

    制備不同pH值毒素溶液:先將超純水調(diào)節(jié)pH值為 3、5、7、9(用 0.2 mol/L 鹽酸溶液和 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液),分別取1 mL 100.0 μg/mL的DON、T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到99 mL不同pH值水溶液中,制成1.0 μg/mL 不同 pH 值(3、5、7、9)的 DON、T-2 毒素工作液。

    1.3.2 不同加熱溫度對DON和T-2毒素的影響

    分別取10 mL 1.0 μg/mL pH 值為7的DON、T-2毒素工作液于25 mL具刻度玻璃試管(擰松管塞),在恒溫振蕩器和高壓滅菌鍋中,分別用80、90、100、105、110、115、121 ℃處理 30 min,處理完后,用超純水定容至10 mL,以未處理毒素溶液為對照,用HPLC-MS/MS測定毒素及其衍生物。

    1.3.3 不同加熱時(shí)間對DON和T-2毒素的影響

    分別取10 mL 1.0 μg/mL pH值為7的DON、T-2毒素工作液于25 mL具刻度玻璃試管(擰松管塞),在高壓滅菌鍋中,用 121 ℃分別處理 10、20、30、40、50、60 min,之后定容至10 mL,以未處理毒素溶液為對照,用HPLC-MS/MS測定毒素及其衍生物。

    1.3.4 不同pH值時(shí)加熱對DON和T-2毒素的影響

    分別取 10mL 不同 pH 值(3、5、7、9)的 1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液于25mL具刻度玻璃試管(擰松管塞),在121℃高壓滅菌鍋中,分別加熱60 min,之后定容至10 mL,以未處理毒素溶液為對照,用HPLCMS/MS測定毒素及其衍生物。

    1.3.5 測定DON、T-2毒素及其衍生物

    將待測溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾到HPLC進(jìn)樣瓶中,用HPLC-MS/MS分析。外標(biāo)法定量。

    1.3.6 色譜條件[7]

    流動(dòng)相:B(甲醇);A(水,含 2mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸)。梯度洗脫:0~5 min,5%B;5 min~6 min,5%~95%B;6 min~11 min,95%B。流速:0.3 mL/min。柱溫:40℃。進(jìn)樣量:30 μL。

    1.3.7 質(zhì)譜條件[7]

    掃描方式:正離子模式掃描;檢測模式:多反應(yīng)檢測;氣簾氣壓力:40 Pa(氮?dú)猓?;離子源氣體1:60 Pa(氮?dú)猓浑x子源氣體2:60 Pa(氮?dú)猓?;離子源溫度:650℃;界面加熱器:ON;電噴霧電壓:5 500.00 V;碰撞氣壓力:10 Pa(氮?dú)猓?;其它條件如表1所示。

    表1 DON、T-2毒素及其衍生物的躍遷監(jiān)測及電噴霧離子源條件Table 1 Transitions monitored for DON,T-2 and their derivatives&ESI source conditions

    表1 DON、T-2毒素及其衍生物的躍遷監(jiān)測及電噴霧離子源條件Table 1 Transitions monitored for DON,T-2 and their derivatives&ESI source conditions

    1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

    數(shù)據(jù)處理采用Analyst software 1.5.1。用3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示結(jié)果。采用PASW Statistics 18軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,顯著性水平0.05,采用一維方差分析差異顯著性分析,圖上標(biāo)不同大寫字母表示數(shù)值差異顯著(P<0.05),相同大寫字母表示數(shù)值差異不顯著(P>0.05)。

    式中:R為毒素去除率,%;c0為處理前毒素濃度,μg/mL;c1為處理后毒素濃度,μg/mL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同溫度熱處理對DON和T-2毒素的影響

    DON、T-2毒素濃度受加熱溫度的影響見圖1。

    由圖1可知,pH值為7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液在80℃~121℃溫度范圍內(nèi),加熱30 min,溶液中DON濃度保持穩(wěn)定;在80℃~100℃溫度范圍內(nèi),加熱30min,溶液中T-2毒素濃度保持穩(wěn)定,在105℃~121℃溫度范圍內(nèi),加熱30 min,溶液中T-2毒素濃度不斷降低。與對照組(未加熱處理)相比,105、110、115、121℃處理30min,T-2毒素去除率分別為(9.21±3.17)%、(10.89± 2.57)%、(12.28 ± 2.38)%、(15.94 ±2.18)%。

    圖1 DON、T-2毒素濃度受加熱溫度的影響Fig.1 Effect of heating temperature on concentrations of DON and T-2 toxin

    2.2 不同加熱時(shí)間對DON和T-2毒素的影響

    DON、T-2毒素濃度受加熱時(shí)間的影響見圖2。

    由圖2可知,在121℃加熱10 min~60 min,溶液中DON濃度保持穩(wěn)定,溶液中T-2毒素濃度不斷降低,與 0 min(未加熱處理)相比,121 ℃處理 10、20、30、40、50、60 min,T-2毒素去除率分別為(5.94±3.17)%、(10.89±2.77)%、(15.94±2.08)%、(28.32±2.18)% 、(41.58±2.67)%、(51.98±3.37)%。

    圖2 DON、T-2毒素濃度受加熱時(shí)間的影響Fig.2 Effect of heating time on concentrations of DON and T-2 toxin

    2.3 不同pH值條件下熱處理對DON和T-2毒素的影響

    熱處理中DON濃度受pH值的影響見圖3。

    圖3 熱處理中DON濃度受pH值的影響Fig.3 Effect of pH value of DON solution on DON concentration by heat treatment

    由圖3可知,pH值9的未加熱處理對照溶液中DON濃度降為(0.935±0.026)μg/mL,DON去除率為(7.50±2.60)%;pH值(3、5、7)的未加熱處理對照溶液中DON濃度保持穩(wěn)定。pH值(3、5、7)的處理溶液(121℃處理60 min)中DON濃度保持穩(wěn)定;pH值9的處理溶液(121℃處理60min)中DON濃度降為(0.755±0.031)μg/mL,DON 去除率為(25.50± 3.10)%,與 pH值為9的DON對照溶液相比,DON去除率增加了(18.00±0.50)%。

    熱處理中T-2毒素濃度受pH值的影響見圖4。

    由圖4可知,pH值9的未加熱處理對照溶液中T-2毒素濃度降為(0.95±0.035)μg/mL,T-2毒素去除率為(5.00±3.50)%;pH值(3、5、7)的未加熱處理對照溶液中 T-2毒素濃度保持穩(wěn)定。pH 值(3、5、7、9)的處理溶液(121℃處理60 min)中T-2毒素濃度分別降為 (0.485 ± 0.021)、(0.480 ± 0.023)、(0.475 ±0.022)、(0.317±0.031)μg/mL,T-2毒素去除率分別為(51.50±2.10)%、(52.00±2.30)%、(52.50±2.20)%、(68.30±3.10)%。其中pH值9的處理組(121℃處理60 min)與pH值為9的對照組(未加熱處理)相比,T-2毒素去除率增加了(63.30±0.40)%。

    圖4 熱處理中T-2毒素濃度受pH值的影響Fig.4 Effect of pH value of T-2 toxin solution on T-2 toxin concentration by heat treatment

    2.4 分析熱處理DON和T-2毒素

    檢測上述經(jīng)過熱處理DON、T-2毒素溶液,未發(fā)現(xiàn)毒素衍生物 DOM-1、15-A-DON、3-A-DON、DON-3-葡萄糖苷、T-2四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2、NEO,推測可能將其轉(zhuǎn)化為其它未知產(chǎn)物。

    在本研究中,DON在中酸性(pH值為3、5、7)條件下,121℃加熱10 min~60 min,DON濃度保持穩(wěn)定,在堿性(pH值為9)條件下,未加熱處理,DON濃度降低,說明DON在堿性條件下不穩(wěn)定,Young等[13]也曾說明過這一點(diǎn)。在本試驗(yàn)中,在堿性(pH值為9)條件下121℃加熱60 min DON濃度降低,與中酸性(pH值為3、5、7)條件下121℃加熱60 min DON濃度保持穩(wěn)定相比,說明堿性條件能促進(jìn)DON的熱降解。目前關(guān)于DON的熱穩(wěn)定性研究,大多數(shù)集中在糧食及制品在熱加工過程中對DON的影響。Numanoglu等[14]研究了面包加工工藝對對面包中DON含量的影響,發(fā)現(xiàn)面包焙烤工藝能降低DON含量。Pronyk等[15]研究了過熱蒸汽對DON的去除作用,185℃過熱蒸汽以0.35 m/s速度通過小麥6 min,能去除52%的DON,特別適合干物料中DON的去除,作用方式是熱降解,而不是溶解和提取作用。Bretz等[16-17]研究了熱處理對DON、NIV的影響,在堿性條件下,DON產(chǎn)生3種已知物質(zhì)(norDON A、norDON B、norDON C)和 4 種未知物質(zhì)(norDON D、norDON E、norDON F、9-羥甲基DON內(nèi)酯),NIV產(chǎn)生了4種產(chǎn)物norNIV A、norNIV B、norNIVC、NIV 內(nèi)酯,同時(shí)用永生人類腎臟上皮(IHKE)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn),毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,產(chǎn)物的細(xì)胞毒性要低于原形DON、NIV。

    在本研究中,T-2毒素在堿性(pH值為9)條件下未加熱處理,濃度降低,說明T-2毒素在堿性條件下不穩(wěn)定,這和DON類似。T-2毒素中酸性(pH值為3、5、7)條件下 105℃~121℃加熱 30 min~60 min,T-2 毒素濃度降低,說明T-2毒素在中酸性(pH值為3、5、7)條件下熱穩(wěn)定要低于DON。在堿性(pH值為9)條件下121℃加熱60 min,T-2毒素的去除率要高于在中酸性(pH值為3、5、7)條件下121℃加熱60 min的去除率,說明堿性條件能促進(jìn)T-2毒素的熱降解。目前關(guān)于T-2毒素的熱穩(wěn)定性研究報(bào)道不多,僅Beyer等[18]研究T-2毒素在加熱條件下與α-D-葡萄糖的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)生成3種產(chǎn)物,用永生人類腎臟上皮(IHKE)細(xì)胞做毒性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性要低于T-2毒素。

    在本研究中,毒素類型、熱處理溫度、熱處理時(shí)間、毒素溶液pH值對DON、T-2毒素?zé)峤到庑Ч绊懞艽?,這和Samaraeva等[19]、Rustom等[20]的研究結(jié)果類似,他們研究發(fā)現(xiàn),在熱降解AF中,AF的類型、加熱溫度和時(shí)間、熱穿透力、水分含量、pH值、離子強(qiáng)度,在熱降解中起著重要作用。

    3 結(jié)論

    研究結(jié)果表明在一定條件下熱處理對DON、T-2毒素具去除作用,去除效果受到毒素類型、熱處理溫度、熱處理時(shí)間、毒素溶液pH值的影響。因此,在一定條件下,可考慮將熱處理方法作為去除該類毒素的一種措施。

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    Removal of Deoxynivalenol and T-2 Toxin by Thermal Treatment

    ZOU Zhong-yi1,HUANG Fei1,SUN Jian-li1,F(xiàn)ENG Zhi1,SHI Rui-ting1,LI Hong-jun2,*
    (1.Department of Logistics Management,China Maritime Police Academy,Ningbo 315801,Zhejiang,China;2.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400716,China)

    The effects of temperature,thermal time and pH value of toxin solutions on the removal of deoxynivalenol(DON)and T-2 toxin by thermal treatment were investigated.The concentration of toxins and their derivatives were analyzed by HPLC-MS/MS and quantified by external standard method.DON remained stable at 121℃for 60 min in neutral or acidic condition,but alkaline condition promoted thermal degradation of DON.T-2 toxin was degraded at 105℃ for 30 min in neutral or acidic condition,and removal rate of T-2 toxin was(51.98±3.37)%after 60 min of 121 ℃(pH value of toxin solution was 7,and concentration of toxin wase 1.0 μg/mL),and alkaline condition promoted thermal degradation of T-2 toxin.DON and T-2 toxin were removed by thermal treatment under certain conditions.

    deoxynivalenol(DON);T-2 toxin;thermal treatment;removal

    2016-09-17

    國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2009CB118806);寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A610190);公安海警學(xué)院科研發(fā)展基金項(xiàng)目(2013XYPYZ013)

    鄒忠義(1982—),男(漢),副教授,博士,研究方向:食品科學(xué)與工程。

    *通信作者

    10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.002

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